黄嘌呤氧化酶－还原法

13．2．4　黄嘌呤氧化酶－NBT还原法

13．2．4．1　原理

原理与NBT还原法类似，所不同的是采用黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤底物作为的产生体系。后者再将NBT还原为显色物质，通过进行比色测定得知SOD对NBT还原的抑制，并根据抑制率计算样品SOD活性。

13．2．4．2　仪器及试剂

（1）仪器：分光光度计。

（2）试剂：①0．2mol/L磷酸氢二钾（甲液）：称取K₂HPO₄·3H₂O 9．13g，双蒸水溶解并定容至200mL。②0．2mol/L磷酸氢二钾（乙液）：称取K₂HPO₄1．36g，用双蒸水50mL溶解。③0．2mol/L磷酸钾缓冲液（pH为7．8）：取甲液183mL，加乙液17mL混合即成。④0．4mol/L EDTA－NaOH缓冲液（pH为7．8）：称取乙二胺四乙酸（EDTA）1．49g，加双蒸水2～3mL，再加1mol/L NaOH溶液5mL，水浴加热溶解，最后定容至10mL。⑤10mmol/L黄嘌呤：溶于0．1mol/L NH₄OH溶液内。⑥7．5mmol/L氯化硝基四唑氮蓝（也称氮蓝四唑，NBT）：溶于20%乙醇。⑦混合底物缓冲液：各取上述③液135mL、④液0．188mL、⑤液4．5mL、⑥液3．75mL混合，最后加双蒸水补足至240mL。⑧黄嘌呤氧化酶：用时以50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH为7．8）配成0．04u/mL的溶液。⑨SOD标准液：用20%乙醇配制成1mg/mL的贮备液，用前稀释为10μg/mL。

13．2．4．3　步骤

（1）按表13－4加样（单位为mL）。

表13－4　黄嘌呤氧化酶－NBT还原法加样表

（2）各管加样后，置25℃恒温水浴预温5～10min，同时将黄嘌呤氧化酶溶液预温。

（3）各管置25℃水浴中，每间隔30s依次向各管加入预温的黄嘌呤氧化酶（0．04u/mL）0．3mL，各管于25℃水浴内作用12min后取出。

（4）选定测定波长为560nm，以底物缓冲液校正零点，读取各管吸光度值。

13．2．4．4　SOD酶活性计算

单位定义：在以上规定条件下，NBT还原被SOD抑制50%所需的酶量为1u。

上式中A₀——未受SOD抑制的吸光度；A_u——测定样品的吸光度；A_s——SOD标准管的吸光度；10——SOD标准液的浓度10μg/mL；c_Pr——样品液的蛋白质浓度（mg/mL）。

13．2．4．5　注意事项

（1）若样品对NBT还原的抑制范围在35%～65%，基本上可按上式计算SOD酶活性，超过此范围可适当浓缩或稀释样品液，再行测定。

（2）测定过程中加入黄嘌呤氧化酶12min后，反应达到平台，在以后的30～60min内吸光度值无明显变化，故选取12min测定吸光度值。

（3）温度对本法测定有影响。温度越高，达到对NBT还原抑制50%所需的SOD量越多，反应速率加大，吸光度值增高；而温度过低，则测定灵敏度下降。

（4）用20%乙醇配制的SOD标准液，于4℃可保存45天。

（5）待测样品不可混浊。NBT反应还受组织中其他蛋白质等杂质影响，因此测定生物组织样品中SOD含量，其结果会受到影响。NBT还易与有机自由基如RO·或ROO·反应。

（6）采用本法测定SOD活性的灵敏度较细胞色素c还原法高，将黄嘌呤浓度降低可再提高灵敏度。

（7）NBT还原机制复杂，中间物NBT自由基既可与NBT自由基结合成为甲暅，也可与O₂发生可逆反应生成，即NBT既可清除又可生成。因此SOD对NBT还原反应的作用有两种可能性，一是与NBT竞争，使NBT的还原反应受到抑制，二是催化歧化，使NBT自由基与O₂的可逆反应平衡趋向于NBT再生。