高效凝胶色谱分析法

14．2．2　高效凝胶色谱分析法

凝胶色谱法是一种按照溶质分子大小进行分离的色谱技术，又称体积排阻色谱。溶质流出凝胶柱的速率取决于其分子的大小和凝胶阻滞作用的差异。在正常情况下，分子按由大到小递减的次序洗脱出来。按流动相类型的不同，凝胶色谱可以分为两类：流动相为有机溶剂时称凝胶渗透色谱；流动相为水溶液时，称为凝胶过滤色谱。凝胶色谱法广泛用于生物大分子尤其是蛋白质的分离和纯度分析。

（1）试剂。凝胶色谱洗脱剂不直接影响分离度，但是应该考虑洗脱剂对试样分子的影响，一般应该综合考虑凝胶性质、缓冲液的pH值和离子组成、分离介质或者表面活性剂的影响等。不带电荷的物质可以用蒸馏水作为洗脱剂，带电荷样品的洗脱可用Tris－HCl、磷酸盐等缓冲液体系。为防止离子与凝胶介质的相互作用，可以选用NaCl进行调节。

（2）操作方法。凝胶色谱法已经有多种品牌的高效液相色谱仪可供选择进行自动化分析，在此不作详细说明。

（3）应用举例。

①红细胞SOD的纯度分析。王永权等建立了一条从红细胞裂解液中同时制备SOD、过氧化氢酶和血红蛋白的工艺，并运用凝胶过滤色谱法对酶的纯度进行了鉴定。分析条件：WATERS 2695－2995高效液相系统；层析柱为Shodex Protein KW－308凝胶过滤填充柱；流动相为含0．1mol/L硫酸钠的磷酸盐缓冲液（50mmol/L，pH＝7．0）；流速为0．5mL/min；分析时间30min；检测波长280nm和259nm。结果如图14－5所示。图14－5显示，纯化的SOD的纯度为77．6%，接近于Sigma公司试剂级牛红细胞SOD（86%）；纯化的SOD的A₂₅₉/A₂₈₀为1．39，与SOD标准品的1．40十分相近。

②重组SOD的纯度分析。Yi－Jen Lian等用酵母表达系统表达了一种cDNA编码的Mn－SOD，利用Ni－NTA亲和色谱进行纯化，利用凝胶过滤色谱对纯化后的酶进行了分析。分析条件：Shodex Protein KW－802．5分析柱，8mm×300mm；流动相为pH为6．8的磷酸钾溶液；流速1mL/min；检测波长280nm；SOD样品（8．7μg/20μL）。分析结果如图14－6所示。

图14－5　纯化SOD在Shodex Protein KW－308填充柱的凝胶过滤色谱图

A—纯化的牛血红细胞SOD；B—牛血红细胞SOD标准品（Sigma）；实线为280nm吸收峰；虚线为259nm吸收峰。

图14－6　纯化SOD的凝胶过滤色谱分析

d—二聚体；m—单聚体