动物血的制备技术

15．3．1　动物血SOD的制备技术

动物血SOD的制备技术以猪牛红细胞SOD的制备技术为例。

A．技术路线

B．工艺过程

①收集、浮洗。取新鲜猪血，离心除去黄色血浆，红细胞用9g/L（0．9%）氯化钠溶液离心浮洗，反复洗三次，得干净红细胞。

②溶血、去血红蛋白。干净红细胞加去离子水，在5℃下搅拌30min，然后加入0．25倍体积的95%乙醇和0．15倍体积的氯仿，搅拌15min，离心去血红蛋白，收集上清液。

③沉淀、热处理。操作温度在0℃左右，将上清液加入1．2～1．5倍体积的丙酮，产生大量絮状沉淀，离心，除去上清液，得沉淀物。再将沉淀物加适量去离子水后使其溶解，离心，除去不溶性蛋白，上清液于55℃～65℃热处理10～15min，离心，除去大量热变性蛋白，收集黄绿色的上清液。

④沉淀、去不溶蛋白、透析。在0℃操作条件下，将上清液加入适量丙酮，使其产生大量絮状沉淀，离心除去上清液，沉淀再加去离子水，充分搅匀，离心除去不溶性蛋白，清液置透析袋中动态透析6～8h，得透析液。

⑤吸附、洗脱、超滤、浓缩、冻干。将透析液小心加到已用2．5mmol/L、pH为7．6的磷酸缓冲液平衡好的DEAE－Sephadex A－50柱上吸附，用pH为7．6、2．5～50mmol/L的硫酸钾缓冲液进行梯度洗脱，收集具有SOD活性的洗脱液，超滤、浓缩、冷冻干燥，即得SOD成品。

⑥电泳鉴定条件。用5g/L（0．5%）琼脂糖凝胶平板电泳，缓冲液为pH为8．4的三羟甲基氨基甲烷－甘氨酸，电压梯度为22V/cm，电流为3mA/cm，电泳时间为35min，固定染色液5g/L（0．5%）氨基黑10B，脱色液为7g/L（0．7%）乙酸。

C．说明

①通常操作温度应控制在5℃，最好在0℃左右。一般制备全过程为2～4d。

②猪血SOD溶于不同pH的磷酸盐缓冲液中，于30℃下保温，测定其酶活性。猪血SOD在pH为7．6～9比较稳定，pH为6以下、pH为12都不稳定，pH为2时SOD极不稳定，10min后酶活仅有12．5%，45min后酶活仅有3%。

③沉淀蛋白质采用有机溶剂（如氯仿、乙醇、丙酮等）和加热相结合的方法效果较好。

④国内外用得最多的是DE－32、CM－32和DEAE－Sephadex A－50等，上柱时要注意pH和盐浓度，pH决定酶分子的带电状态，盐浓度决定结合键的强弱。为得到高纯度的SOD，洗脱时常用梯度洗脱。

⑤由于SOD对热较稳定，故在提取过程中可采用热去除杂蛋白，常用反应的温度和相应的作用时间为55℃，15～30min；60℃，10～25min；65℃，10～15min。通常反应温度为65℃～70℃，时间为10～12min。

⑥去血红蛋白也可采用铜盐法。