二定糖法实验的注意事项

时间：2023-02-10 理论教育版权反馈

【摘要】：反应式如下：DNA分子在强酸作用下降解生成的脱氧核糖可在乙酸和浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊醛，该化合物可与二苯胺反应生成蓝色化合物，其最大吸收峰波长为595nm。DNA对RNA的测定有干扰，在用Cu2+作催化剂时，同时有减少DNA干扰的作用，改良地衣酚法即用CuCl2作催化剂。其他糖及其衍生物和醛类化合物对测定有干扰，应尽量避免。

定糖法（_生物化学实验

二、定糖法（DNA、RNA含量的测定）

（一）实验目的

1．了解定糖法测定核酸含量的原理。

2．掌握定糖法测定核酸含量的方法。

（二）实验原理

RNA分子在强酸作用下降解生成的核糖可在浓盐酸作用下脱水生成糠醛，糠醛可与3，5-二羟基甲苯（地衣酚、苔黑酚）作用生成绿色复合物，其最大吸收峰波长为670nm，Fe³⁺或Cu²⁺可作为催化剂催化反应。反应式如下：

DNA分子在强酸作用下降解生成的脱氧核糖可在乙酸和浓硫酸作用下脱水生成ω-羟基-γ-酮戊醛，该化合物可与二苯胺反应生成蓝色化合物，其最大吸收峰波长为595nm。反应式见实验八。

（三）实验药品、实验设备

1．1 mol/L氢氧化钠溶液；

2．100μg/mL RNA标准液：用称量瓶准确称取含RNA10mg的酵母核糖核酸（按其含量进行折算），加适量蒸馏水溶解，滴加数滴lmol/L氢氧化钠溶液调节pH至7，使其完全溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水洗涤称量瓶2次，洗涤液合并入容量瓶，用蒸馏水定容，混匀；

3．RNA样品溶液：用称量瓶准确称取粗制RNA10mg，按上法配制或者取“核酸的提取、分离及鉴定”实验中提取的RNA溶液备用；

4．浓盐酸（A.R.）；

5．地衣酚试剂：预先将地衣酚在苯中重结晶1～2次，用活性炭脱色，干燥后备用。称取地衣酚0.1g，加浓盐酸100mL使溶解，再加入二水合氯化铜（CuCl₂·2H₂O）0.15g，使其溶解，混匀；

6．100μg/mL DNA标准液：用称量瓶准确称取含DNA 10mg的脱氧核糖核酸（按其含量进行折算），加适量蒸馏水溶解，滴加数滴lmol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7，使其完全溶解，转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水洗涤称量瓶2次，洗涤液合并入容量瓶，加蒸馏水至刻度，混匀；

7．DNA样品溶液：用称量瓶准确称取粗制DNA10mg，按上法配制，或者取“核酸的提取、分离及鉴定”实验中提取的DNA溶液备用；

8．冰乙酸（A.R.）；

9．浓硫酸（A.R.）；

10．二苯胺试剂：预先将二苯胺在70％乙醇中重结晶l～2次，干燥后备用，称取重结晶二苯胺1g，加冰乙酸100mL使其溶解，再加入浓硫酸lmL，混匀，贮于棕色瓶中，该试剂应为无色，如变色则氧化失效；

11．分光光度计；

12．分析天平；

13．电热恒温水浴箱；

14．水浴锅；

15．容量瓶；

16．刻度吸管；

17．称量瓶；

18．试管架；

19．15mm×150mm试管；

20．滴管。

（四）实验方法

1．RNA含量的测定

（1）标准曲线制备

取试管6支，编号，按表4-2所示顺序和剂量加入试剂。将各管混匀，置沸水浴中加热20min，取出，水浴冷却至室温，用分光光度计在670nm波长下，以“0”号管试液作参比溶液调零，测定各管吸光度。以RNA含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

表4-2　定糖法测定RNA含量的工作曲线

（2）样品RNA含量测定

取试管3支，分别标以“空白管”和“测定管”（2支）。在空白管中加入蒸馏水1.0mL，在测定管中加入RNA样品溶液1.0mL，然后每管加入地衣酚试剂3.0mL，混匀，置沸水浴中加热20min，取出，水浴冷却至室温，用分光光度计，在670nm波长下，以空白管作参比液调零，测定样品测定管吸光度，分别在标准曲线上查出RNA含量，取平均值。

2．DNA含量的测定

（1）标准曲线制备

取试管6支，编号，按表4-3所示顺序和剂量加入试剂。将各管混匀，置于60℃水浴中加热60min，取出，水浴冷却至室温，用分光光度计在595nm波长下，以“0”号管调零，测定各管吸光度。以DNA含量为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

表4-3　DNA含量测定的工作曲线

（2）样品中DNA含量测定

取试管3支，分别标以“空白管”和“测定管”（2支）。在空白管中加入蒸馏水1.0mL，在测定管中加入DNA样品溶液1.0mL，然后每管加入二苯胺试剂3.0mL，混匀，置于60℃水浴中加热60min，取出，水浴冷却至室温，用分光光度计，在595nm波长下，以空白管调零，测定2支样品测定管的吸光度，分别在标准曲线上查出DNA含量，取平均值。

3．结果计算