重组dna分子如何表达基因

第二节　基因工程

上世纪90年代，美国上映了两部科幻电影《侏罗纪公园》和《失落的世界》，在全世界范围内掀起了一股经久不衰的恐龙热。观众对作者非凡的科幻想象能力发出由衷的赞叹，作者竟能想象从琥珀——史前树液的石化树脂中提取出远古时期吸血昆虫肚子里的恐龙血，从中分离恐龙DNA(脱氧核糖核酸)，破译恐龙的遗传密码，然后利用基因工程技术，人工无性繁殖出侏罗纪时期和白垩纪时期的恐龙。

赞叹之余，许多人可能要问了:什么是基因工程技术?为什么想象用基因工程技术繁殖恐龙?

基因(gene)是一段可以编码，具有某种生物学功能物质的核苷酸序列。基因工程(geneticengineering)是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，也就是基因克隆技术。重组，顾名思义，就是重新组合，即利用供体生物的遗传物质，或人工合成的基因，经过限制性内切酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物之中构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出新的生物性状。

基因工程一般包括四个步骤:一是取得符合人们要求的目的基因;二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA分子;三是把重组DNA引入某种细胞;四是把能表达目的基因的受体细胞挑选出来。由于基因工程是在分子水平上进行操作，从而突破物种间的遗传障碍，超越物种间的不亲和性，创造出人们所需要的新品种。因此，科学家们可以利用基因工程实现人类对各种物种改良的愿望。比如，将一种生物的DNA中的某个遗传密码片段连接到另外一种生物的DNA链上去，将DNA重新组织一下，就可以按照人类的愿望，设计出新的遗传物质并创造出新的生物类型(如图10－1)。

图10－1　人源目的基因克隆至大肠杆菌的操作

这种做法就像技术科学的工程设计，按照人类的需要把来自某种生物的某个“基因”与另一生物的某个“基因”重新“施工”，“组装”成新的基因组合，创造出新的生物。这种完全按照人的意愿，由重新组装基因到新生物产生的生物科学技术，就称为“基因工程”，或者说是“遗传工程”。基因工程具有两个重要特征:首先，外源DNA分子在不同的宿主生物中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自其他生物的基因放置到新的生物中，而这种生物可以与原来生物毫无亲缘关系，这种能力是基因工程的第一个重要特征。第二个特征是，一种确定的DNA小片段在新的宿主细胞中进行扩增，这样实现很少量DNA样品复制出大量的DNA，而且是大量没有污染任何其他DNA序列的、绝对纯净的DNA分子群体。

一、基因工程的工具酶

基因工程的操作是分子水平上的操作，它是依赖一些重要酶作为工具来对基因进行切割和拼接等操作的，所以把这些酶称为工具酶。基因的重组与分离，涉及一系列相互关联的酶催化反应。已经知道有许多种重要的工具酶(表10－2)，例如从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链核酸外切酶、从核酸分子内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段的核酸内切酶，以及以mRNA为模板合成互补链DNA的反转录酶等，在基因克隆的实验中都有着广泛的用途。

表10－2　重组DNA实验中常用的工具酶

二、基因工程的载体

基因工程是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此其最基本的工程就是要得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列自身不能繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。基因克隆载体(gene cloning vector)就是指运载外源DNA有效地进入受体细胞内的工具。在体外，载体同外源DNA重组，DNA重组分子在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。

因此，对理想的基因工程载体一般至少有以下几点要求:(1)具有在宿主细胞中进行高效的自主复制的能力。(2)容易进入宿主细胞，而且进入效率越高越好。(3)载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点，使外来核酸片段易于插入。(4)容易从宿主细胞中分离纯化出来，这才便于重组操作。(5)具有利于选择的标记基因，当其进入宿主细胞，或携带着外来的核酸序列进入宿主细胞，都能容易被辨认和分离出来。

基因工程操作中最常用的载体有质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母人工染色体BAC、HAC和YAC等。质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。早期用于基因工程的载体是经遗传改良的细菌质粒，它们仅能用于克隆分子量小于10kb的外源DNA片段。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同类型的质粒载体，近年来发展很快，新的有特定用途的质粒不断被创建。噬菌体是感染细菌的一类病毒，利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入噬菌体DNA的非必需部分。利用λ噬菌体作载体可插入15kb～23kb的外源DNA片段。质粒和噬菌体载体只能在细菌中繁殖，不能满足真核DNA重组需要。感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于动物细胞的培养和操作较复杂，花费也较多，因而病毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其中，使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁殖和克隆，然后再引入真核细胞。目前常用的病毒载体有改造来自猴肾病毒SV40(Simian Virus40)、逆转录病毒和昆虫杆状病毒等。上述几种载体都不能携带大于50kb的外源片段，而很多真核生物基因长度在50kb以上，细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)载体就是为了克隆更大的外源DNA片段而设计构建的。

三、基因工程的步骤

1.目的基因的获取

基因工程技术首先要获取目的基因。所谓目的基因就是人们在基因工程操作过程中所需要转移或改造的基因。获取目的基因的途径是从生物中直接提取或人工合成，可以归纳为以下几种:

(1)鸟枪法，这种方法类似于鸟枪发射散弹。具体的做法是:用若干个合适的限制酶处理一个DNA分子，将它切成若干个DNA片段。这些片段的长度相当于或略大于一个基因。然后，将这些不同的DNA片段分别与适当的载体结合，形成重组DNA，再将它导入到相应的营养缺陷型细菌中。最后，把这些细菌中的这段DNA分离出来。这种方法的缺点是专一性较差，分离出来的有时并非一个基因。但由于这种方法操作简便，所以现在仍然广泛采用。

(2)PCR法，是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。通过特异设计的一对引物，实现在体外对目的基因的快速扩增，它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点。

(3)反转录法，这种方法是在分离细胞总RNA的基础之上实现的。以mRNA为模板，用反转录酶合成一个互补的DNA，即cDNA单链，再以此单链为模板合成出互补链，就成为双链DNA分子。这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定，生存时间短，所以要求的技术条件较高。

(4)人工合成，这种方法主要是通过DNA自动合成仪，通过固相亚磷酸酰胺法合成。这种方法目前仅限于合成核苷酸对较少的一些简单基因，而且需要预先知道核苷酸序列。对于许多复杂的、目前尚不知道核苷酸序列的基因就不能用这种方法合成，只能用其他方法分离或合成。这种合成基因的方法还有一个很大的优点，就是可以人工合成自然界不存在的新基因，使生物产生新的性状以满足人类需求。因此，这一方法今后将随着技术的不断改进而得到越来越广泛的应用。

2.目的基因与载体的连接

在通过不同的途径获取了目的基因，选择或构建适当的基因载体之后的工作是如何将目的基因与载体连接在一起，即DNA的体外重组。基因重组是基因工程的核心。载体DNA和目的基因的连接，按DNA片段末端性质不同，可以有不同的连接方法，主要有粘末端DNA片段的连接和平末端DNA片段的连接。采用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段;或用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来;或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)－poly(dT)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来;又或者先在DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头，使之形成粘性末端之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异，但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。

3.重组DNA导入受体细胞及重组体的筛选与鉴定

外源基因与载体在体外连接成重组DNA分子后，需要将其导入受体细胞进行扩增和筛选，以期得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖或称克隆。由于外源基因与载体构成的重组DNA分子性质不同，宿主细胞不同，将重组子导入宿主细胞的具体方法也不相同。重组DNA导入受体细胞的方法，大体上可划分为转化、转染、转导、微注射技术及基因枪技术等。

通过转化、转染、转导等导入方式，重组DNA分子被导入受体细胞，经过培养得到大量所需转化子菌落或转染噬菌斑。下一步需要将重组体的转化子细胞或转染噬茵体群体从其他细胞群体中分离出来，并要鉴定克隆的外源基因确实为目的基因，这一过程即为筛选。

在基因工程上使用的所有载体分子，都带有一个可选择的遗传标记或表型特征。质粒以及柯斯载体具有抗药性记号(如四环素抗性和氨苄卡那霉素抗性)或营养记号，而对于噬茵体来说，噬茵斑的形成则是它们的自我选择特征。根据载体分子所提供的遗传特性进行选择，是获得重组体DNA分子群体的必不可少的条件之一。这种遗传选择法，使我们能够将重组体的DNA分子同非重组体的亲本载体分子区别开来。抗药性记号的插入失活作用，或者是诸如β－半乳糖苷酶基因一类的显色反应，便是属于这种依据载体编码的遗传特性选择重组体分子的典型方法