植物组织培养技术利用了什么原理

细胞工程_现代生物学导论

第三节　细胞工程

细胞工程是以生物细胞或组织为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状，生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。细胞工程涉及的领域非常广泛，从研究水平上来划分，细胞工程可分为细胞水平、组织水平、细胞器水平和基因水平等几个不同的研究层面。依据所研究的对象不同，分为植物细胞工程技术、动物细胞工程技术两大类。此外，微生物细胞工程技术也在迅速兴起。细胞工程主要由上游工程和下游工程两部分构成，其中上游工程包含细胞培养、细胞遗传操作和细胞保藏三个步骤，而下游工程则是将已转化的细胞应用到生产实践中去，以生产生物产品的过程，其中细胞培养是细胞工程的技术基础。细胞工程的目的，是得到人们所需要的生物产品。要使已经改造好的细胞产生大量具有经济价值的产物，就必须依靠下游加工过程，也就是下游工程，它的作用就是大量培养细胞，并从培养液中分离、精制出有关的生物化工产品。

一、植物细胞工程

植物细胞工程是细胞工程的一个重要组成部分。植物细胞工程(plant cell engineering)是一种利用离体培养细胞进行遗传操作，实现植物品种改良或获取次生代谢产物的生物技术。细胞工程的理论基础是细胞学说和细胞全能学说。自1904年Hanning成功培养离体胚以来，伴随着相关理论与技术如细胞融合及DNA重组等现代生物技术的出现，植物细胞工程取得了巨大的成就。现在，我们已经可以利用细胞融合及DNA重组等现代生物技术，从细胞和分子水平改良现有品种甚至于组建新品种。

1983年转基因植物问世，1986年首批转基因植物被批准进入田间试验，至今国际上已有30个国家批准数千例转基因植物进入田间试验，涉及的植物种类有40多种。不仅如此，一些转基因植物已经开始进行商业化生产。从1994年Calgene公司的延熟番茄FLAVRSAVRTM成为首例被批准进行商业化生产的转基因作物开始，截至1997年1月，美国已批准十七例，加拿大十八例，澳大利亚四例，日本七例。

我国农业部也已于1997年上半年批准了转基因延熟番茄的商业化。由此可见，植物细胞工程将对我们的生活产生越来越大的影响。我们应对此加以重视，了解一些新的研究成果及新技术，以求在生物工程这个21世纪的龙头产业中占有一席之地。

1.植物细胞工程的原理及培养技术

植物细胞工程涉及诸多理论原理，但最为根本的就是细胞的全能性。由于每个细胞都来自受精卵，都带有与受精卵相同的遗传信息，因此生物的每个细胞经过分裂和分化后，仍然保持发育成完整个体的潜在能力，即完整个体中的细胞保持着潜在的分化为各种细胞、组织和器官的全能性。通常细胞分化完成后，就受到所在环境的束缚，相对稳定，一旦脱离原来所在环境成为离体状态时，在适宜的营养和外界条件下，就会表现出分裂增殖和分化的潜能，生长发育成完整个体。受精卵就是全能性细胞的典型代表。细胞全能性为开展细胞工程研究提供了广阔空间。

植物细胞工程的实际操作技术，最重要的就是培养技术，也就是将植物的器官、组织、细胞甚至细胞器进行离体地、无菌地培养。它是对细胞进行遗传操作及细胞保藏的基础。此类技术发展起步较早，相对而言已比较成熟，各种培养基制备及很多操作方法已经基本规范化。

针对植物的培养主要有植物组织培养、植物细胞培养、花药及花粉培养、离体胚培养以及原生质体培养这几个大类，每一种都还可以继续细分为更具体的小类。组织培养首先将外植体分离出来，然后在无菌及适当条件下培养以诱导出愈伤组织(callus)。另外在愈伤组织随外植体生长一段时间后还需要进行继代培养，以避免代谢产物积累及水分散失等因素的影响。细胞培养可分为悬浮细胞培养、平板培养、饲养层培养和双层滤纸植板等几类，它们都是将选定的植物细胞于适当的条件下进行培养，以得到大量基本同步化的细胞，为遗传操作提供材料。花粉及花药培养主要是使花粉改变正常发育途径而转向形成胚状体和愈伤组织，从而产生单倍体植株。离体胚培养有幼胚与成熟胚培养两类，通过使用相应的培养基使离体胚正常地萌发生殖，以供研究和操作使用。原生质体的培养则是一切利用原生质体进行遗传操作的基础，它是将取得的植物细胞去除细胞壁形成原生质体后进行培养，具体方法与细胞培养有一定的相似之处。作为后继操作的基础，培养技术的选择是非常重要的。采用适当的培养方法可以更好地进行遗传操作和保存细胞，而错误的选择有可能影响结果甚至导致试验和生产失败，造成时间和金钱的浪费。

2.植物组织培养

植物组织培养(tissue culture)又称植物无菌培养，是指在无菌条件下，将外植体(植物器官、组织、胚胎)培养在人工配置的培养基上，在无菌和人为控制外界环境(光、温、湿等)的条件下，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或长成新的完整植株的试验技术。

19世纪30年代，德国植物学家施莱登和德国动物学家施旺创立了细胞学说，根据这一学说，如果给细胞提供和生物体内一样的条件，每个细胞都应该能够独立生活。1902年，德国植物学家哈伯兰特提出的细胞全能性的理论是植物组织培养的理论基础。1958年，美国植物学家斯蒂瓦特等人用胡萝卜韧皮部的细胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结果，证实了哈伯兰特在五十多年前关于细胞全能的预言。至此植物组织培养技术被广泛的应用。

植物组织培养的一般过程(图10－2):在无菌条件下，将植物器官或组织(如芽、茎尖、根尖或花药)的一部分切下来，用纤维素酶与果胶酶处理用以去掉细胞壁，使之露出原生质体，然后放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。

图10－2　植物组织培养的一般过程

3.植物细胞培养

植物细胞培养是在植物组织培养技术基础之上发展起来的，指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织接种到培养基，通过培养使细胞增殖，从而获得大量的细胞群体的一种技术。

根据培养对象的不同，植物细胞培养主要分为单细胞培养、单倍体培养、原生质体培养(用机械、酸处理或酶溶解等方法除去细胞壁，分离出原生质体进行培养)等。单细胞培养主要是观察细胞个体如何进行分裂、分化、生长及发育，为植物细胞的大规模培养奠定基础。单倍体培养主要指花药培养，即将花药在人工培养基上进行培养，从小孢子直接发育成胚状体，然后长成单倍体植株或通过愈伤组织诱导分化出芽和根，最终长成植株。原生质体培养指将原生质体置于无菌培养基上分裂、分化，最终形成植株。不同植物的原生质体融合后可获得体细胞杂交株(图10－3)。

图10－3　植物原生质体融合过程

按照培养系统的不同，植物细胞培养又可分为悬浮培养、液体培养、固体培养、固定化培养等。液体培养一般可分为两种:静止培养和振荡培养。静止培养适用范围较窄，常用于某些原生质体的培养。振荡培养需要摇床或转床等设备。细胞悬浮培养属于液体培养的一种，通过机械或气体搅拌实现细胞的悬浮，是植物大规模培养的主要方式。与微生物培养相似，植物细胞的悬浮培养也包括分批培养、半连续培养(流加培养)和连续培养三种方式。

4.植物原生质体培养

原生质体为植物遗传工程研究提供了一个方便的遗传操作实验系统。

(1)原生质体的制备

生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响着原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。用于原生质体分离的植物外植体有叶片、叶柄、茎尖、根、子叶、茎段、胚、愈伤组织、悬浮培养物、原球茎、花瓣和叶表皮等。由于叶片易获得且能充分供应，因此叶肉细胞是常用的材料。取材时，一般用刚展开的幼嫩叶片。另一个分离原生质体的常用材料是愈伤组织或悬浮细胞，采用其作材料可以避免植株生长环境的不良影响，可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作方便，无需消毒。对较脏的外植体往往要先用肥皂水清洗，再以清水洗2～3次，然后浸入70%乙醇溶液消毒后，放进3%次氯酸钠溶液或氯化汞溶液处理。最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

选用悬浮细胞作材料时，需每隔3～5天继代一次，培养一段时间使细胞处于旺盛生长状态。一般在继代后的第三天游离原生质体。

由于植物细胞的细胞壁含纤维素、半纤维素、木质素以及果胶质等成分，因此需用纤维素酶分解植物细胞壁。从理论上讲，只要用适当的酶处理，就能从任何活组织中分离得到原生质体。但是对于原生质体培养来说，要得到活性高、能进行分裂、形成愈伤组织、最后再生完整植株的原生质体，则受许多因素的影响。有时在酶解前需适当地对植物材料进行预处理，如枝条暗处理、叶片预培养、预先质壁分离处理等，从而改变细胞和细胞壁的生理状态，增加细胞膜的强度，达到提高细胞壁酶解的效率，减少原生质体损伤的目的。

酶解后的反应液中除了有的原生质体外，还有一些残留的组织块和破碎的细胞。为了取得高纯度的原生质体，就必须进行原生质体的分离。分离方法主要有三种:过滤法、低速离心法和比重漂浮法。普遍采用过滤法，选取孔径20～80μm的金属或尼龙筛网进行过滤除渣，滤去未被酶解的组织残余物，然后将原生质体与酶液的混合物转移到离心管中，离心后收集原生质体。

刚分离得到的原生质体往往还含有酶及其他不利于原生质体培养、再生的试剂，应以新的原生质体洗液或原生质体培养液离心洗涤2～4次。

荧光素双醋酸盐(FDA)活体荧光染色法是鉴定原生质体最为常用的方法，在荧光显微镜下观察时，凡是发淡绿色荧光的都是生活的原生质体，无荧光或荧光很微弱的已经死亡。

(2)原生质体的培养方法

原生质体培养的方法大体上分为四种:固体培养、液体培养、固体液体结合培养和滋养培养。培养方法的选择对于原生质体的生长和分裂非常重要。对于容易分裂的植物原生质体，可以采用简单的固体培养或液体浅层培养。较难培养的原生质体则需要采用固体、液体结合培养乃至看护培养。近年来，随着新的培养技术和方法(琼脂糖包埋、液体浅层、固体双层及看护培养)的出现，解决了以往难以培养成功的豆科、禾本科和某些木本植物的原生质体的问题。

固体培养是在微生物培养基础之上发展起来的植物细胞培养方法，一般在培养基中加一定比例的琼脂，故又称琼脂培养。过程如下:将琼脂加倍(约1.2%)的原生质体培养基溶化后，待冷却至45℃左右与制备好的原生质体悬浮液等体积迅速混合，倒入培养皿中，同时轻轻摇动，使得原生质体均匀分布在琼脂中，待琼脂凝固后用石蜡封口。固定化培养是固体培养的一种，但不是使用固体培养基，而是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在其表面上，这样有利于细胞的分化和组织化，也利用对环境因子参数的调控。常见的固定化细胞培养系统有以下两大类:平床培养系统和立柱培养系统。

液体培养可分为微滴培养和浅层培养两种。微滴培养是将悬浮的密度为每毫升104～105个原生质体的培养液，用滴管以0.1ml左右的小滴，一滴一滴地接种到培养皿上。由于表面张力的作用，小滴以半球形保持在培养皿表面，如果将培养皿反转过来，则成为悬滴培养。微滴培养的优点是如果其中一滴或几滴发生污染，不会殃及整个实验。缺点是原生质体分别不均匀，集中在小滴中央，且与空气接触面大，液体容易蒸发，使培养基浓度提高。液体浅层培养是一种有效方法，将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，液层不要太厚，以免通气不良而导致原生质体不易分裂。石蜡膜密封以减少培养液蒸发，培养初期每天需要轻摇2次，以防止原生质体与容器底部粘连。

微滴培养是由液体浅层培养发展起来的一种方法。将0.1m1或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于培养皿或凹玻片的底部，封口后进行培养。

滋养培养利用能够分泌生物活性物质的细胞或组织培养物作为滋养者来促进原生质体的分裂和生长。一般过程如下:将滋养细胞洗涤后均匀平铺在固体培养基上，覆以硝酸纤维膜，然后将需培养的原生质体悬浮液滴于滤膜上，石蜡膜密封培养皿，适宜温度培养。培养一段时间后需更换滋养系统。

(3)原生质体融合与体细胞杂交

原生质体融合的方法有自发融合、化学法诱导细胞融合、物理法诱导细胞融合三种。自发融合指在酶解细胞壁过程中，由于胞间连丝的扩展和粘连，有些相邻的原生质体能彼此自发融合，形成多核体。化学法诱导细胞融合是用不同的化学试剂诱导细胞融合。物理法诱导细胞融合是将双亲本原生质体以适当的溶液悬浮混合后，插入微电极，接通一定的交变电场。原生质体极化后顺着电场排列成紧密接触的珍珠串状。此时瞬间施以适当强度的电脉冲，则使原生质体细胞膜被击穿而发生融合。电激融合不使用有毒害作用的试剂，作用条件比较温和，且基本上是同步发生融合，条件适当时可获得较高的融合率。

(4)杂合体的鉴别与筛选

在经过融合处理的原生质体群体中，既有未融合的亲本原生质体，也有同核体、异核体和各种其他的核—质组合。因此，在体细胞杂交中，最重要的是鉴别和选择出杂合细胞。鉴别与筛选过程包括:①杂合细胞的显微镜鉴定。②互补法筛选杂合细胞。③形态学观察。④育性的检查。⑤染色体数目与核型的检查。⑥生物化学与分子生物学检测。

(5)胚状体的形成和植株的再生

原生质体在一定的培养条件下短时间内开始膨胀成球状。随着叶绿体重新排列，并开始合成新的细胞壁，进而由球形变成椭圆形。在合适的培养基和培养环境中，细胞能持续分裂。细胞不断分裂形成细胞团，进而形成愈伤组织由细胞系形成胚状体。通过采用合适的培养基，并调节生长素和分裂素的比例，诱发芽和根的生成。一般是先诱导芽的生成，然后诱导根的形成。这种途径是目前通过原生质体再生植株的主要途径。

二、动物细胞工程

动物细胞工程是细胞工程的又一个重要分支，它主要从细胞生物学和分子生物学的层次，根据人类的需要，一方面深入探索、改造生物遗传种性;另一方面应用工程技术的手段，大量培养细胞或动物本身，以期收获细胞或其代谢产物以及可供利用的动物。可见，动物细胞工程不仅具有重要的理论意义，而且它的应用前景也十分广阔。1997年，英国Wilmut领导的小组用体细胞核克隆出了“多莉”(Dolly)绵羊(图10－4)，把动物细胞工程推上辉煌的世纪顶峰。

图10－4　克隆羊“多莉”产生的过程

动物细胞培养是离体动物细胞在无菌培养条件下，在合适的培养基和环境中分裂、生长的过程，在整个培养过程中细胞不出现分化(图10－5)。动物细胞培养有两种方式:一种是非贴壁培养，也就是细胞在培养过程中不贴壁，条件较为复杂，难度也大一些，但容易同时获得大量的培养细胞。这种方法一般用于淋巴细胞、肿瘤细胞和一些转化细胞的培养，这类细胞也可采用微生物培养方式进行悬浮培养。另一种是贴壁培养，此类细胞体外生长不必贴壁，可在培养液中悬浮生长，因此也叫悬浮型细胞。一些在体内原本就以悬浮状态生长的细胞或微生物，如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等，当接种于体外环境中也可以以悬浮状态生长。悬浮培养类似微生物的深层培养，细胞密度较高，培养效率高，操作容易，易于大规模生产，便于过程的控制。淋巴细胞等不贴壁生长的细胞已被成功地进行了悬浮培养。大规模培养可稍加改进，采用微生物发酵罐，如搅拌转速减慢、搅拌叶改为螺旋桨式、通气装置通过硅橡胶管扩散等。还有—些细胞，既可贴壁生长，也可悬浮生长，但是能在悬浮状态下生长的细胞种类有限。

图10－5　动物细胞培养过程

1.细胞培养的常用技术和方法

(1)组织块培养法:取出需培养的目的组织，用营养液漂洗，弃去不健康的或坏死的部分。用组织解剖刀将材料切成1～2mm²的组织块，用移液管将这些组织块移至培养瓶瓶底。添加培养液后，翻转培养瓶使组织块脱离培养液10～15min(37℃)，以使组织块能贴附于容器的底面上。然后再翻转过来静置培养，待由迁移细胞组成的生长晕有足够大的时候，用物理方法或化学的方法将细胞取下移至另一培养瓶中传代。

(2)悬浮细胞原代培养法:待培养的组织或瘤块漂洗和挑选后先剪碎，再将这些剪碎的组织块置于无钙无镁但含有某些蛋白酶(多为胰蛋白酶)或整合剂的溶液中温育，使之尽量分散为单细胞悬液。酶或整合物的工作时间、工作浓度及温度等则因组织而异。将由此所获得的细胞以一定的数量移植至培养瓶内，静置30min至24h不等，以使其贴附在容器的底面上。细胞增殖到一定数量即可将之转移到另一培养瓶以传代。常规的细胞传代技术是先加入适量的胰酶或EDTA，使贴壁的细胞游离，分散为单细胞，离心后，弃去上清液及混和其中的胰酶等，换入新鲜培养液，用滴管吹打沉淀的细胞使之悬浮，继续分装入新的培养瓶，静置于培养箱中继续培养。

(3)细胞的无血清培养(serum free medium，SFM):是不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长繁殖的合成培养基。但是它们可能包含个别蛋白或大量蛋白组分。虽然基础培养基加少量血清所配制的完全培养基可以满足大部分细胞培养的要求，但对有些实验却不适合，如观察一种生长因子对某种细胞的作用，这时需要排除其他生长因子的干扰作用。而血清中可能含有各种生长因子;又如需要测定某种细胞在培养过程中分泌某种物质(抗体、生长因子)的能力;或者要大规模的培养某种细胞，以获得它们的分泌产物。

血清是动物细胞培养中最基本的的添加物，尤其是在原代培养或者细胞生长状况不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛以后，再换成无血清培养液。细胞转入无血清培养之前，要留有种子细胞，种子细胞按常规培养于含血清的培养基中，以保证细胞的特性不发生变化。细胞转入无血清培养基培养要有一个适应过程，一般要逐步降低血清浓度，从10%减少到5%、3%、1%，直至无血清培养。在降低过程中要注意观察细胞形态是否发生变化，是否有部分细胞死亡，存活细胞是否还保持原有的功能和生物学特性等。在实验后这些细胞一般不再继续保留，很少有细胞能够长期培养于无血清培养基而不发生改变的。

(4)动物细胞大规模培养技术:动物细胞的大量培养既能提供足够数量的有应用价值的细胞，又能获得足够数量的由哺乳动物细胞合成并分泌的、在临床或研究中有应用价值的代谢产物。动物细胞大规模培养技术是生物工程发展中一项关键的技术。

(5)微囊法(microencapsulation):微囊法也是一种理想的细胞培养方法，是用一层亲水的半透膜将细胞包围在珠状的微囊里，细胞不能逸出，但小分子物质及营养物质可自由出入半透膜。微囊直径控制在200～400μm为宜，囊内的微小培养环境，与液体培养相似，能保护细胞少受损伤，故细胞生长好、密度高。

(6)多孔载体培养法:多孔载体是近年来才发展起来的一种用于大规模高密度动物细胞培养的细胞支持物，其内部具有网状结构的小孔，细胞能在其内部生长，可降低血清用量，增加细胞固定化的稳定性。

2.动物细胞融合及筛选

细胞融合指两个或更多细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。细胞融合是研究细胞间遗传信息转移、基因在染色体上的定位以及创造新细胞株的有效途径。19世纪30年代，科学家们相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。上世纪70年代，在蛙的血细胞中也同样观察到了多核细胞的现象，但是由于受当时科学技术发展水平的限制，人们对这一现象并没有给予足够的重视。1958年，日本科学家岗田用灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功。随后，不同种动物的体细胞融合技术也获得成功，并且能将杂种细胞培养成活。随着细胞融合技术的不断改进，现在这项技术已经广泛应用于细胞学、遗传学、免疫学、病毒学等多种学科的研究工作中。

在体外培养条件下，动物细胞会自发融合，但是频率极低。因此，一般都需要添加具有诱导细胞融合效应的生物或化学药剂，或者采用电融合技术，人为地促进细胞融合。动物细胞的融合途径有三种:病毒融合剂诱发细胞融合;化学融合剂诱发细胞融合;电激诱发细胞融合。

病毒是最早采用的融合剂。用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或β－丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。用灭活的仙台病毒诱导细胞融合，融合率较高，对各种动物细胞都适宜，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养。但是仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。

聚乙二醇PEG是最常用的化学融合剂，其具有强烈的吸水性以及凝聚和沉淀蛋白质的作用，除了能够有效地促进动物细胞的融合，也能促进植物原生质体的融合。在不同种类的动物细胞混合液中加入PEG，就会发生细胞凝集作用;在稀释和除去PEG的过程中，就会发生细胞融合。PEG诱导细胞融合的机理，目前还不太清楚，但使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，由于它有一定毒性，对某些细胞(如卵细胞)不适用。

电融合技术是20世纪80年代建立起来的细胞融合技术，是将两种细胞的混合液置于低压交流电场中，使细胞聚集成串珠状，然后施加高压电脉冲，以促使细胞融合。紧密排列的细胞，在相互接触的细胞膜之间会出现无蛋白颗粒的脂质区，当受到电击时，这个区域就会被击穿，产生脂双层膜孔，导致细胞之间的细胞质连通，进而发生细胞融合。电融合技术有许多优点，如诱导细胞融合的频率高，对细胞无毒害作用，操作简便，可重复性好。

并非所有的细胞都能融合。细胞融合本身又带有一定的随机性，除不同亲本细胞间的融合外，还伴有各亲本细胞的自身融合，需设法把含两亲本细胞染色体的杂种细胞分离或筛选出来。最简便的办法无疑是应用选择培养基，使亲本细胞死亡，而仅让杂种细胞存活下来。为此，已先后利用亲本细胞的药物抗体、营养缺陷型和温度敏感性等遗传标记，建立了许多选择系统，并成功地用于杂种细胞的筛选。现在已分离得到的突变型主要有:药物抗性突变型、营养缺陷突变型、温度敏感突变型、紫外线敏感突变型等。如使用HAT选择培养法鉴别融合细胞，所谓HAT培养筛选系统是指由黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶组成的培养筛选系统，其中A阻断核酸的从头合成，H、T是为应急合成途径提供外源核苷酸“前体”，因核酸的应急途径需HGPRT酶(次黄漂呤磷酸核糖转移酶)和TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶)的参与，故缺乏HGPRT酶的细胞株不能在含HAT的培养液中生长，但如果这样的细胞株和能提供HGPRT酶的细胞融合后则可在含HAT的培养液中存活。因此，如果融合细胞的亲本之一是能在体外长期生存的细胞系，而另一亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞，则将长期培养细胞株突变成HGPRT或TK酶缺陷的细胞株并与正常细胞融合后，未融合的细胞在HAT培养液中会死亡，而体外生存能力有限的正常细胞最终也会死亡，故存活下来的只有含两亲本遗传物质的融合细胞。

3.干细胞

干细胞工程是利用现代生物医学和组织工程技术，通过对胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞和皮肤、肌肉等前体细胞，进行体外分离纯化、定向诱导分化、转基因及核移植、大量扩增和整合构建，在体外重构人骨、软骨、肌肉、肌腱、脂肪、真皮、基质、神经、血管、皮肤、角膜以及造血和免疫等组织。它作为组织工程的“上游”研究，对未来的组织器官修复和替代具有极其重要的作用和深远的影响。在组织器官的细胞来源、细胞扩增与定向诱导分化、重构组织器官的种类、重构效率、重构组织器官的植入等方面，与传统的组织工程相比均存在着明显的不同和优势，其中骨髓基质干细胞是研究热点。

干细胞是目前细胞工程研究最活跃的领域。随着基础研究、应用研究的进一步深化，这项技术将会在相当大程度上引发医学领域的重大变革，已成为21世纪生命科学领域的一个热点。造血干细胞是发现最早、研究最多和最先用于治疗疾病的成体干细胞，长期以来，一直认为干细胞只属于造血系统。近年来，随着干细胞研究的不断深入，几乎在所有组织中都发现了干细胞。干细胞生物学和干细胞生物工程已成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科。

(1)干细胞定义及类型

干细胞(stem cell)是一类具有多向分化潜能和自我复制能力的原始的未分化细胞，是形成哺乳类各组织器官的原始细胞。按分化潜能的大小，干细胞可分为三种类型:全能性干细胞，即胚胎干细胞，是最原始的干细胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化发育潜能，具备发育成完整个体的能力;多能性干细胞，这种干细胞具有分化出多种细胞、组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制;单能干细胞，一般认为这类干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，但随着干细胞研究的飞速发展，有报道单能干细胞可分化为其他类型的细胞。

(2)干细胞研究的现状及最新进展

干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最为引人注目的领域，其理论的日臻完善和技术的迅猛发展必将在疾病治疗和生物医药等领域产生划时代的成果，是对传统医疗手段和医疗观念的一场重大革命。采用干细胞治疗有着多种优势:低毒性(或无毒性)，即使不完全了解疾病发病的确切机理治疗也可达到较好的治疗效果，自身干细胞移植可避免产生免疫排斥反应，对传统治疗方法疗效较差的疾病多有惊人的效果。

尽管人胚胎干细胞有着巨大的医学应用潜力，但围绕该研究的伦理道德问题也随之出现。这些问题主要包括:人胚胎干细胞的来源是否合乎法律及道德?应用潜力是否会引起伦理及法律问题?从体外受精人胚中获得的ES细胞在适当条件下能否发育成人?干细胞要是来自自愿终止妊娠的孕妇该如何办?为获得ES细胞而杀死人胚是否道德?是不是良好的愿望为邪恶的手段提供了正当理由?使用来自自发或事故流产胚胎的细胞是否恰当?一些人争辩，从人胚中收集胚胎干细胞是不道德的，因为人的生命没有得到珍重，人的胚胎也是生命的一种形式，无论目的如何高尚，破坏人胚是不可想象的。而某些人辩称，由于科学家们没有杀死细胞，而只是改变了其命运，因而是道德的。有些人担心，为获得更多的细胞系，公司会资助体外受精获得囊胚及人工流产获得胎儿组织。他们建议应该鼓励成人体干细胞研究而应放弃胚胎干细胞研究。

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPScells)最初是日本人山中申弥于2006年利用病毒载体将四个转录因子(Oct4，Sox2，Klf4和c－Myc)的组合转入分化的体细胞中，使其重编程而得到的类似胚胎干细胞的一种细胞类型。随后世界各地不同科学家陆续发现其他方法同样也可以制造这种细胞。IPS细胞技术的建立之初，科学家深感震撼，因为这种细胞具有胚胎细胞缺乏的在人类研究疾病工作中的用途的两大优点:一是没有争议，无需毁坏人类胚胎;二是因用病患本身的皮肤细胞制成，所以应当不会受到免疫系统的排斥。然而，2011年5月，《自然》期刊发表研究报告指出，用皮肤干细胞制成的细胞组织，尽管是来自同一病患体内的细胞，都可能受到病患体内免疫系统的排斥，这项报告让干细胞治病的前景受到挫折。

三、微生物细胞工程

微生物工程的主体是利用微生物生长代谢产生的各种生理活性物质来生产商品，主要是指采用细胞工程的某些技术实现改造微生物种性、创造新品种的目的。

1.通过微生物原生质体技术活动新菌株

根据不同微生物细胞壁的结构与成分有针对性地选择溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶或酵母裂解酶酶解去除微生物细胞壁，同时为了提高酶消化效果，常需在培养基中加入细胞壁合成抑制剂。菌体细胞壁全部消化或部分破裂后即可释出原生质体。通过使用高渗溶液，使原生质体再生并鉴别原生质体遗传特征。注意原生质体再生条件要求严格，不同微生物原生质体再生条件往往不同，亲缘关系相近的原生质体其再生条件也可能有所差异。通过化学法(融合剂为PEG)或电融合法诱导微生物的原生质体融合。

原生质体融合后，经遗传物质交换即可产生融合子。融合子产生后一般有三种方法进行筛选:(1)在选择性培养基上检出合适的融合子，包括直接法和间接法。直接法:将融合混合物接种于不加二亲株生长所需的营养物或同时添加两种药物的培养基上，直接选出原营养型或具有双重抗药性的杂种菌株;间接法:先把融合混合物接种于再生培养基上，使亲株及融合子都能生长，然后移至选择性培养基上，凡能生长者即为杂种菌株。(2)荧光染色法进行融合子的鉴别:将两亲株用不同的荧光染料标记，融合后在荧光显微镜下进行鉴别，融合子内应存在两种荧光染料。(3)流式细胞仪光度计进行荧光染料标记的融合子的鉴别，此方法具有迅速、准确的优点。

2.微生物细胞培养

得到合适的微生物菌株后，必须进行增殖和继代培养，以培养基状态来分，有固体培养法和液体培养法。(1)固体培养指培养基为固体，通常是琼脂斜面培养法。(2)利用液体培养基进行微生物的生长繁殖称液体培养法，根据通气方式的不同又分为液体表面培养法和液体深层培养法。液体表面培养即液体浅盘培养或静置培养，此种方法由培养基表面进行气体交换。液体深层培养是将微生物置于装有液体培养基的密封发酵罐中进行培养。此法目前应用较为普遍。厌氧培养时无需通气，好氧培养时则需配备搅拌和通气装置。微生物细胞培养过程中必须满足营养、适当的温度、pH值及溶解氧等。