发酵工程和蛋白质工程

第五节　发酵工程和蛋白质工程

一、发酵工程

发酵工程是生物工程的主要基础和支柱。17世纪时荷兰人列文虎克发明了显微镜，用显微镜发现了微生物，也看到了酿酒的酵母中有微生物，即酵母菌。但是，酵母菌究竟是发酵的“因”还是发酵的“果”，直到19世纪才由法国化学家、微生物家巴斯德搞清楚。他通过确凿的实验证明，没有活的酵母菌就不能引起发酵，酒变质则是由于有其他微生物在起作用。至此，人们才知道了微生物在发酵过程的作用，也有了防止酒变质的方法——巴斯德灭菌法。巴斯德本来定义发酵为微生物在缺氧条件下的生理过程，在这种条件下不能把糖类物质彻底氧化为二氧化碳和水，而是生成了酒精和乳酸等物质。现在发酵这一术语则泛指一切利用微生物生产产品的过程，包括厌氧发酵和好氧发酵。

发酵工程技术可以分为上游技术、中游技术和下游技术三个阶段。上游技术主要是指菌种的选育。优良菌种的选育不仅为发酵工业提供了高产生产菌株，还可以提供各种类型的突变株，改善其生理生化特性，去除多余的代谢途径和产物，有利于合成新的产物，改善发酵工艺条件，提高产品质量，增加经济效益。

菌种选育不仅需要微生物学、微生物遗传学、生物化学和分子遗传学的理论基础，而且也是应用性很强的实用技术。在优良菌种选育过程中要全面地、辩证地分析问题，灵活而又巧妙地将理论与技术结合，应用于菌种选育的实践中。目前在菌种选育中主要还是采用自然选育和诱变育种的方法，工作量大，带有一定的盲目性，尚属于经典的遗传育种范畴。近20年来，由于分子生物学和分子遗传学的发展，基因工程、蛋白质工程、细胞融合、代谢工程等技术作为具有定向作用的育种方法，获得一定成功，受到人们的高度重视，并以极大的热情探索这些新技术在育种上的应用。

中游技术是指微生物的发酵生产，其本质是具有相同特性的微生物在控制条件下的培养。微生物发酵的方法很多，大致可归为固体发酵和液体发酵两大类，液体发酵是当今发酵工业的主体。固体发酵是利用固体培养基进行微生物生产，它是一种传统的微生物生产方法，如酱油的酿造，食用菌生产中玻璃瓶装固体发酵等。固体发酵最常用的原料是农副产品，如麸皮、米糠、豆饼、山芋粉。对于好氧菌可采用油层固体培养法，使用曲盘等一些简单设备，在曲室里保温、保湿培养，以获得大量的固体曲。所谓“曲”是指发酵后的基质、微生物及其代谢产物混杂在一起的总称，如酒曲、糖化曲。对于厌氧菌可使用大缸、水泥池等，造成一个厌氧环境，任其发酵。固体发酵的优点是设备简单，投资少，适合小规模生产;缺点是占地大，劳动强度高，产品质量不太稳定。随着它的推广普及，又有不少创新和改进，如目前酱油酿造、乙醇发酵等大工业生产多采用通风发酵池生产法。

下游技术也称为下游加工过程，是生物化学工程的组成部分。可分为4个阶段:(1)培养液的预处理和固液分离。(2)初步纯化。(3)高度纯化。(4)成品加工。

二、蛋白质工程

蛋白质工程是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质;或者从蛋白质结构与功能的关系出发，定向地改造天然蛋白质的结构，特别是对功能基因的修饰，也可以制造新型的蛋白质。1983年，美国科学家乌尔莫(Ulmer)在《Science》上发表以“Protein Engineering”(蛋白质工程)为题的专论，一般将此视为蛋白质工程诞生的标志。蛋白质工程的实践依据DNA指导合成蛋白质，因此，人们可以根据需要对负责编码某种蛋白质的基因进行重新设计，使合成出来的蛋白质的结构变得符合人们的要求。由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有诸多同基因工程技术相似的地方，因此蛋白质工程也被称为第二代基因工程。

蛋白质工程第一个十分成功的范例是胰岛素的人工合成。1965年，中国科学院和北京大学生物系联手首次人工合成了牛胰岛素，成了轰动世界的大事。1953年，英国生物化学家桑格(Frederick Sanger)破译出由17种51个氨基酸组成的两条多肽链牛胰岛素的全部结构。这也是人类第一次搞清一种重要蛋白质分子的详细结构，从1958年开始，中国科学院上海生化研究所、上海有机化学研究所和北大生物系三个单位联合成立一个协作组，开始探索用化学方法合成胰岛素。1965年9月7日，协作组完成了结晶牛胰岛素的全合成，经过严格鉴定，这种人工合成的结晶牛胰岛素在结构、生物活力、物理化学性质、结晶形状上都与天然的牛胰岛素完全一样。人工合成结晶牛胰岛素是世界上第一个人工合成的蛋白质，为人类认识生命、揭开生命奥秘迈进了一大步。

当前，蛋白质工程是发展较好、较快的生物技术。这是因为在进行蛋白质分子设计后，已可应用高效的基因工程来进行蛋白的合成。最早的蛋白工程是福什特等在1982～1985年间对酪氨酰－tRNA合成酶的分子改造工作。他根据X射线衍射实测该酶与底物结合部位结构，用定位突变技术改变与底物结合的氨基酸残基，并用动力学方法测量所得变体酶的活性，深入探讨了酶与底物的作用机制。1987年福什特通过用Lys代替枯草杆菌蛋白酶分子表面的Asp(99)和Glu(156)，而导致了活性中心His(64)质子pKa从7下降到6，使酶在pH= 6时的活力提高10倍，从而带来巨大经济效益。蛋白工程还可对酶的催化活性、底物专一性、抗氧化性、热变性、碱变性等加以改变。由此可以看出蛋白工程的威力及其光辉前景。上述各例是通过对关键氨基酸残基的置换与增删进行蛋白工程的一类方法。另一类是以某个典型的折叠进行“从头设计”的方法。1988年杜邦公司宣布，成功设计并合成了由四段反平行α－螺旋组成为73个氨基残基的成果。这显示，按人们预期要求，通过从头设计以折叠成新蛋白的目标已基本成为可能。

蛋白质工程汇集了当代分子生物学等学科的一些前沿领域的最新成就，它把核酸与蛋白质结合、蛋白质空间结构与生物功能结合起来研究。蛋白质工程将蛋白质与酶的研究推进到崭新的时代，为蛋白质和酶在工业、农业和医药方面的应用开拓了诱人的前景。蛋白质工程开创了按照人类意愿改造、创造符合人类需要的蛋白质的新时期。