从牛奶中提取酪蛋白

实训一　从牛奶中提取酪蛋白

实训目的

（）1了解等电点沉淀法制备酪蛋白的原理。

（2）学习从牛奶中制备酪蛋白的方法。

实训原理

蛋白质是两性电解质。蛋白质分子的解离程度受蛋白质溶液的酸碱度影响，能够在一定pH值溶液中维持一个稳定的状态，但是调节蛋白质溶液的pH值至等电点时，蛋白质会因失去电荷而变得不稳定，此时若再加脱水剂或加热，水化层被破坏，蛋白质分子就相互凝聚而析出。等电点沉淀法是利用两性电解质在等电点时溶解度最低，而不同两性电解质具有不同等电点的原理而进行分离的一种方法。

牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g／L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用两性电解质在等电点时溶解度最低的原理，将牛奶的pH值调至4.7时，酪蛋白就会沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀，除去脂类杂质后便可得到较纯的酪蛋白。

由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带水化层的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用等电点沉淀法来分离生物化学产品效果并不太理想，因而生产中常与盐析法、有机溶剂沉淀法一起使用或采用其他沉淀剂，以提高沉淀能力和分离效果。

实训试剂与实训器材

1.实训试剂

（1）消毒牛奶。

（2）95%乙醇。

（3）无水乙醚。

（4）0.2mol／L氢氧化钠溶液。

（5）0.2mol／L乙酸-乙酸钠缓冲液（pH＝4.7）。

先配A液与B液。①A液（0.2mol／L乙酸钠溶液）：称乙酸钠54.44g，定容至2 000mL。②B液（0.2mol／L乙酸溶液）：称纯乙酸（浓度大于99.8%）18.0g，定容至1 500mL。取A液1 770mL，B液1 230mL混合，即得pH＝4.7的乙酸-乙酸钠缓冲液3 000mL。

（6）乙醇-乙醚混合液：乙醇、乙醚体积比为1∶1。

2.实训器材

（1）离心机。

（2）pH值试纸、酸碱度计。

（3）烧杯和容量瓶。

（4）抽滤装置。

（5）电炉。

（6）温度计。

（7）烘箱。

实训步骤

（1）取预先放在冰箱中冷却的消毒牛奶8mL，以3　000r／min离心15 min，用胶头滴管吸取表面的脂肪层牛奶置于50mL烧杯内，同时分别将除去脂肪层的牛奶和8mL、pH＝4.7的乙酸-乙酸钠缓冲液预热至40℃左右，在搅拌牛奶时慢慢加入缓冲液，用精密pH值试纸或酸碱度计调pH值至4.7，混匀，此时，混浊液中有大量絮状物沉积。

（2）将上述混浊液冷却至室温，离心15min（3 000r／min），弃去上清液，即得酪蛋白粗品。

（3）用蒸馏水洗沉淀三次（每次用蒸馏水5mL左右），以3 000r／min离心10min，弃去上清液。

（4）将沉淀置于研钵中，研碎后，用5mL 95%乙醇清洗沉淀一次，静置片刻，将全部悬浮液转移至布氏漏斗抽滤，抽干后的制品再用乙醇-乙醚混合液清洗沉淀两次（每次5mL），分别抽滤，最后用无水乙醚清洗沉淀两次（每次5 mL），分别抽滤。

（5）将沉淀物摊开在表面皿上，置于80℃烘箱内烘干沉淀物，用电子天平称量，并记录所得的纯酪蛋白制品。

（6）酪蛋白溶液的配制：称取酪蛋白0.1g，置于10mL烧杯中，加5mL 0.2mol／L氢氧化钠溶液，搅匀，隔水加热，溶解后转移至10mL容量瓶中，用少量蒸馏水洗烧杯数次，洗液加入容量瓶中，最后加水至刻度处，摇匀，置于冰箱中保存备用。

结果与计算

计算酪蛋白含量和得率。

（1）酪蛋白含量：酪蛋白质量（g）／100mL牛奶。

（2）得率如下。

式中，理论含量为3.5g／100mL牛奶。

注意事项

（1）由于本实训是应用等电点沉淀法来提取蛋白质，故调节牛奶的等电点一定要准确，最好用酸碱度计测定。

（2）纯化过程中使用的无水乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。

（3）目前，市面上出售的牛奶是经过加工的奶制品，不是纯牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。

思考题

（1）为什么调整溶液pH值可使酪蛋白沉淀出来？

（2）试设计另一种提取酪蛋白的方法。