实验四 脂类染色法
【实验目的】
了解和掌握脂类染色的原理和操作方法。
【实验原理】
脂肪主要存积于脂肪组织中，并以油滴状的微粒存在于脂肪细胞浆内。
在病理检验中，脂类染色法最常用于证明脂肪变性、脂肪栓子以及肿瘤的鉴别。脂类染色使用最广泛的染料是苏丹染料，最常用的有苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、苏丹黑及油红O等。脂肪被染色，实际上是苏丹染料被脂肪溶解吸附而呈现染料的颜色。经研究认为组织中脂质在液态或半液态时，对苏丹染料着色效果最好。根据这一原理，适当提高温度(37～60℃)对组织切片染色效果是有好处的。
脂类染色实验中一般用冰冻或石蜡切片，以水溶性封固剂封固，如甘油明胶和阿拉伯糖胶等。
脂类染色法在临床上主要用于鉴别脂滴和糖元;观察肝细胞、心、肾、骨骼肌细胞糖元的分布;鉴别横纹肌瘤和颗粒细胞母细胞瘤，前者阳性，后者阴性;鉴别泡沫细胞瘤和卵巢纤维瘤，前者为阳性，后者为阴性;Fabry病(或称安德森-法布里病)的诊断(Fabry病是一种α-连锁先天性糖鞘脂代谢障碍，细胞浆物质PAS和苏丹黑染色呈强阳性反应)等。
【实验器材】
冰冻切片机、载玻片、盖玻片、染色缸等。
【药品试剂】
1．10%甲醛、酒精、60%异丙醇。
2．苏丹III、苏丹IV混合液:苏丹III 0．2 g，70%酒精50 ml;苏丹IV0．5 g，丙酮50 ml。
3．苏木素。
4．甘油明胶:甘油50 ml、蒸馏水50 ml、明胶10 g、酚0．5 ml。把明胶溶于蒸馏水，搅拌片刻，放入37℃的温箱中过夜。第二天再加入甘油，加入酚防腐，然后存放于4℃冰箱中，用时取出，用热水促其溶解即可使用。
5．油红O染液:油红O(oil red o)0．5 g，异丙醇100 ml。将异丙醇放入三角烧瓶，再加入油红O，于水浴中慢慢加热使之溶解，待完全溶解后取出，冷却至室温后，过滤，装于棕色小磨砂口瓶保存，临用前取6 ml加蒸馏水4 ml，混合后静置10分钟后过滤，染色时间5～15分钟。
6．苏丹黑B染液:苏丹黑B(sudan blank B)0．5 g，70%酒精100 ml。取三角烧杯，装入酒精，再加入苏丹黑，在水浴中边加热边搅拌，直至沸腾达2～3分钟，取出待冷却后过滤，溶液保存于小磨砂瓶中。
7．0．1%核固红染料。
8．2．5%铁明矾水溶液。
9．醋酸-硫酸混合液:取一容器，盛入冰块或冰水，将10 ml冰醋酸装于小瓶后置入冰块中，再加入10 ml硫酸，混合后静置数分钟取出即可。
【实验方法】
1．脂类组织的固定及固定液的选择:脂类组织的固定特别要注意的问题，就是不要选择含酒精的固定液，因为酒精可把脂类物质溶解，因此，用于脂类物质的首选固定液是甲醛，它可较好地保存脂类物质。
2．苏丹III苏丹IV联合法(combined SudanIII IV method for lipids):
(1)用经过甲醛固定过的组织作冰冻切片，厚10～15μm，切完后放入蒸馏水中，染色前放入50%～70%酒精洗。
(2)放入苏丹III苏丹IV染液染5分钟。
(3)70%酒精分化，水洗。
(4)苏木素浅染细胞核。
(5)水洗。
(6)蓝化，如为漂浮染色，此时应将切片附贴于载片。
(7)甘油明胶封固。
结果:脂类物质呈现橘红色或鲜红色，核蓝色。苏丹III染脂肪小颗粒时呈橘黄色，而苏丹IV染脂肪小颗粒时呈红色。
3．油红法:
(1)福尔马林固定后的恒冷箱切片附贴于载片上或游离切片，厚5～10μm。
(2)60%异丙醇稍洗切片。
(3)油红O液染5～15分钟。
(4)60%异丙醇洗去多余染液。
(5)自来水洗。
(6)苏木素染细胞核2分钟。
(7)自来水洗。
(8)水洗至细胞核蓝化5～10分钟。
(9)擦去多余水分，甘油明胶封固。
结果:脂类物质显示红色，细胞核显示蓝色
4．苏丹黑B法:
(1)福尔马林固定的组织恒冷箱冰冻切片，附贴于载片上或收集于装有蒸馏水的小烧杯中，厚5～10μm。
(2)50%～70%酒精稍洗切片。
(3)苏丹黑B染液中染色5～15分钟。
(4)50%～70%酒精洗去多余染液。
(5)蒸馏水洗。
(6)0．1%核固红染细胞核10分钟。
(7)自来水洗10分钟。
(8)擦去切片上多余的水分。
(9)甘油明胶或水性封片剂封固。
结果:脂类物质:黑色，细胞核:红色。
5．漂浮染色法:
(1)选用固定好的组织，用恒冷切片或二氧化碳等冰冻切片均可，切片厚度为5～10μm，收集于小烧杯中，内装有蒸馏水。
(2)用玻璃弯钩将切片钩出，于50%～70%的酒精中稍洗。
(3)将切片钩入染液(上述三种方法中的任一种染液中)浸染5～10分钟。
(4)于50%～70%酒精中洗去多余的染液。
(5)于苏木素染液中染2分钟。
(6)水洗5～10分钟。
(7)挑选完整的切片，浸入50%～70%酒精中，然后放入水中，此时切片由于酒精中的张力，能将切片平整地裱于水的表面，取出载玻片，将切片捞于载玻片上，擦干周边的水分，用甘油明胶或水性封固剂封固切片。
结果:依据选用的染色方法显示出各自的结果。
6．Schultz法显示胆固醇与胆固醇酯:
(1)组织固定于10%福尔马林2天。
(2)冲洗组织，冰冻切片10～20μm。
(3)切片用蒸馏水稍洗。
(4)2．5%铁明矾水溶液氧化切片2天或更长。
(5)蒸馏水洗。
(6)将切片捞于载玻片上，擦干四周水分，但勿令切片干燥。
(7)滴入反应液于切片上并随之盖上盖玻片。
结果:胆固醇和胆固醇酯呈绿色反应，当反应时间延长至30分钟时，反应物转变为棕褐色。
【注意事项】
1．凡用做脂类染色的组织不管是什么组织，都不能用含有酒精的固定液做固定，必须用福尔马林或福尔马林钙等固定。
2．用做脂类染色的切片不能用石蜡切片，只能用各种冰冻切片。
3．做脂类染色时，最好是用漂浮染色技术，因该技术能使切片更加充分地染色，漂浮的切片对于脂类的保存更好。
4．在漂浮染色时，当切片从70%酒精移入水时由于酒精的关系导致切片表面张力而浮于水面，并发生打转，如此切片发生碰撞而出现破裂的现象，影响切片的完整性。可以用玻璃钩钩住切片，小心慢慢地放入水中，不使其浮出水面，当切片上含有的酒精离去后，切片会沉入水中或沉入染液中。
5．切片封固时，不能烤干或令其自然干，应在湿片的情况下封片。
6．如果切片出现过多的气泡，不能强行将其压出，应将切片放入水中，退去盖片，再行封片，如果将气泡强行压出，将有可能导致脂滴移位的危险。
7．染色时间，不应千篇一律，应视各种组织含有的脂类物质而确定染色时间，
8．染液遇水易发生沉淀，染色时应该尽量减少切片水分的含量，进入染液时切片应尽量擦干水分。
9．配好的染液应密封保存，减少与空气的接触，防止发生氧化或挥发而发生沉淀。
10．胆固醇和胆固醇酯显示好坏，取决于切片氧化的程度，本法用2．5%的铁明矾氧化2天或更长，如果在2天里的氧化效果不好，则可再延长氧化时间。
11．皮尔斯主张2．5%的铁明矾用0．2 mol/L醋酸盐缓冲液来配制，且于37℃处理7天。
12．配制醋酸和硫酸混合液，纯度要求较高，应用分析纯以上，如纯度较低，杂质含量较高，混合时可产生大量的气泡，影响观察。
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