血清中甘油三酯的测定

实验十三　血清中甘油三酯的测定

【实验目的】

了解和掌握血清中甘油三酯的测定意义、原理和操作方法。

【实验原理】

甘油三酯(TG)又称中性脂肪。血清中90%～95%是TG，TG中结合的脂肪酸分别为油酸(44%)、软脂酸(26%)、亚油酸(16%)和棕榈油酸(7%)。

血清TG测定方法一般分为化学法和酶法。化学法多采用三棕榈精(软脂精)(分子量807．3)、三油精(分子量895．4)为标准，按摩尔浓度计算。酶法测定以三油精为标准物进行换算。

化学测定法包括下面四个阶段:①TG的抽提分离;②皂化;③甘油的氧化;④氧化生成甲醛显色定量。血清中加入异丙醇提取甘油三酯，经KOH皂化使甘油三酯水解生成甘油及脂肪酸;甘油在过碘酸作用下氧化成甲醛;在氯离子存在下甲醛与乙酰丙酮缩合生成黄色化合物，其颜色的深浅与甘油三酯的含量成正比，420 nm处定量测定。

酶法测定步骤包括下面两个阶段:①TG的抽提与皂化;②酶反应后进行定量测定。甘油三酯经脂肪酶水解为甘油和脂肪酸，甘油和ATP在甘油激酶(GK)的作用下生成3-磷酸甘油和ADP，3-磷酸甘油经磷酸甘油氧化酶作用生成磷酸二羟丙酮和过氧化氢。过氧化氢、4-氨基替吡啉和苯酚在过氧化物酶(POD)的作用下反应生成红色的醌类化合物，然后在500 nm处测定吸收值，化合物颜色的深浅与含量成正比。

【实验材料】

人血清。

【实验器材】

试管、恒温水浴锅、高速冷冻离心机、分光光度计等。

【药品试剂】

1．溶液1:磷酸甘油氧化酶≥3 kU/L，抗坏血酸氧化酶≥1 kU/L，甘油激酶≥0．7 kU/L，4-氨基安替吡啉80 mg/L，4℃冷藏。

2．溶液2:脂蛋白脂酶≥2 kU/L，过氧化物酶≥10 kU/L，ESPAS 300 mg/L，4℃冷藏。

3．标准甘油酸三脂溶液:2．26 mmol/L，4℃冷藏。

4．抽提液:异丙醇重蒸馏。

5．吸附剂:将氧化铝用水洗以除去微细颗粒，然后在110℃烤干3小时以上，密封，一周内使用。

6．皂化剂:5%KOH。

7．2 mol/L醋酸溶液:取醋酸11．5 ml，用水定容到100 ml。

8．0．05 mol/L过碘酸钠:过碘酸钠1．07 g用水溶解，定容到100 ml。

9．氧化剂:等体积的2 mol/L醋酸溶液和0．05 mol/L过碘酸钠混合，一周内使用。

10．醋酸铵液:醋酸铵15．4 g溶于水后，定容到100 ml。

11．显色剂:乙酰丙酮0．75 ml，异丙醇40 ml，醋酸铵液100 ml，醋酸溶液80 ml。

【实验方法】

1．乙酰丙酮法测定血清中的甘油三酯:

(1)抽提:准备三支试管，分别标记为空白管、测定管和标准管。在测定管中加入血清0．1 ml，抽提液5 ml，吸附剂0．5 g，振荡30～60分钟(期间静止后再振荡若干次)，然后在3000 r/min条件下离心10分钟。

(2)皂化:将离心后的上清液2 ml转移到一个新的标记好的测定管中，加入0．1 ml皂化剂;空白管中加入2 ml抽提液和0．1 ml皂化剂;标准管中加入2 ml标准三油酸甘油酯，加入0．1 ml皂化剂。将三支试管在50℃水浴锅中保温15分钟。

(3)氧化:取出温浴后的三支试管，分别加入0．1 ml氧化剂，室温静止放置10分钟。

(4)显色:在三支试管中分别加入1．5 ml显色剂，在50℃水浴锅中保温40分钟，然后在自来水中冷却。

(5)测定:用空白管调零，在410nm波长下测定其余两管的吸收值，标准管测定的数值记录为T，测定管测定的数值记录为A。

(6)计算:血清TG浓度=A/T×1．13(mmol/L)。

2．酶法(GK-GPO-POD比色法)测定血清中的甘油三酯:

(1)准备三支试管，分别标记为空白管、测定管和标准管。在空白管中加入16μl水和1 ml溶液1;测定管中加入16μl血清和1 ml溶液1;在标准管中加入16μl标准甘油酸三脂溶液和1 ml溶液1。混匀后在37℃水浴15分钟。

(2)分别向三支试管中加入0．5 ml溶液2，混匀后在37℃保温5分钟。

(3)以空白管调零，在550 nm波长下测定标准管和测定管中溶液的吸收值，分别记录为T和A。

(4)计算:血清TG浓度=E_SA/E_ST×2．26(mmol/L)。

【思考题】

1．简述化学法和酶法测定血清中甘油三酯的原理和基本的操作步骤。

2．试比较化学法和酶法测定甘油三酯的优缺点。