利用农杆菌介导的植物转基因技术

第二节　利用农杆菌介导的植物转基因技术

对于植物分子生物学研究来说，获得外源基因转化的植株是非常重要的。事实上，正是由于植物转基因技术的发展使得植物分子生物学的研究取得了突破性的进展。转基因技术对于阐明某些特异基因在植物生长和发育中所起的作用至关重要。如将外源基因启动子连上报告基因后转入植物，可以较为详细地研究植物某一特定基因的表达量、表达部位、相关调控序列的活性及其功能。此外，在植物基因工程的应用研究中，将抗性基因或者控制重要农艺性状的基因转入重要的经济作物或农作物中是植物遗传育种的一个重要手段。

按照转化后基因表达的时效，植物转基因系统可分为瞬间转化和稳定转化。瞬间表达的转化系统指的是植物通过一定的转基因方法导入外源基因后，可以在短时间内(如数小时)检测到其表达的产物，但随后几天表达水平逐渐降低并消失的转基因系统。在瞬时表达系统中，外源基因DNA片段导入细胞后，大部分未整合到染色体上，而是以游离状态存在于细胞核中。瞬时表达的转化系统在基因表达调控研究中得到了广泛的应用，它可用于测定RNA和蛋白质的早期积累以及确定植物蛋白质的细胞内定位。此外，在研究环境条件下或者植物激素等刺激条件对基因表达调控的影响时，检测外源转化基因的瞬时表达可为研究这些刺激因子在调控基因表达方面的机制提供信息。

与瞬时表达系统不同的是，通过稳定表达的转基因系统获得的转基因植物能够稳定地将转入植物体中的外源基因传代，并保持活性。此时外源基因整合到核基因组DNA分子上。一般为获得较高的转化效率和方便操作，需根据实验材料的不同选择不同的转化方法。如在烟草稳定转化中多使用叶盘转化方法;在拟南芥稳定转化中，多使用花浸法(flower dip method)等。虽然不同实验材料所使用的转化方法各有不同，但是一般采用根瘤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法，此外常用的还有发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。

根瘤农杆菌属于农杆菌属的革兰氏阴性菌，最适生长温度为25～30℃，生长的最适pH值范围为6.0～9.0。根瘤农杆菌广泛侵染双子叶植物，一般认为单子叶植物对农杆菌无敏感性，但近年来研究表明，农杆菌对有些单子叶植物也有侵染能力，并在加入外源刺激物质如乙酰丁香酮的条件下，侵染能力增强，同样可以达到介导基因转化的效果。根瘤农杆菌根据其诱导植物细胞产生的冠瘿碱的不同可分为章鱼碱型(octopine type)、胭脂碱型(nopaline type)和农杆碱型(agropine type)。

Ti质粒是根瘤农杆菌染色体外的遗传物质，为双链共价闭合的环状DNA分子，其分子量为95×10⁶～156×10⁶ U，约有200～300kb。Ti质粒可分为4个区，分别是:

(1) T-DNA区(transfer DNA region): T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物细胞的一段DNA。该片段上的基因与肿瘤的形成有关。

(2) Vir区(virulence region):该区段的基因能够激活T-DNA转移，使农杆菌表现出毒性，故称为毒性区。T-DNA区和Vir区在质粒DNA上彼此相邻，合起来约占Ti质粒的三分之一。

(3) Con区(regions encoding conjugations):该区段上存在着与细菌间结合转移有关的基因(tra)，该基因负责调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称为结合转移编码区。

(4) Ori区(origin of replication):该区段的基因负责调控Ti质粒的自我复制，故称为复制起始区。

虽然有关农杆菌侵染植物的分子机理还不清楚，但是已有证据表明农杆菌Ti质粒的T-DNA区域导入植物基因组的整个过程包括下面几个步骤:

(1)农杆菌对受体植物细胞的识别;

(2)农杆菌附着到植物受体细胞表面;

(3)农杆菌中毒性区基因被诱导表达;

(4)类似接合孔复合体的合成和装配;

(5) T-DNA的加工和转运;

(6) T-DNA整合到受体植物细胞的染色体。

野生型Ti质粒直接作为植物基因工程载体存在许多障碍，主要表现在以下几个方面:

(1) Ti质粒过大，提取和鉴定等分子生物学操作十分困难;

(2)大型质粒上各种限制酶均有多个切点，难以找到可利用的单一切割位点的内切酶向野生型Ti质粒导入外源基因;

(3) T-DNA区的Onc基因产物会诱发肿瘤，阻碍转化细胞的分化和再生;

(4) Ti质粒上还存在一些对T-DNA转移不起任何作用的序列;

(5)最为重要的是Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，而农杆菌本身的遗传背景又不太清楚，使得载体的构建难以完成。

为此，必须对野生型Ti质粒进行改造。改造后的转基因载体系统可分为一元载体和双元载体系统。

一元载体系统也称为共整合载体系统。一元载体系统Ti质粒的改造是去除野生型Ti质粒T-DNA中的致瘤基因，引入一段小质粒序列(如pBR322，一种常用的大肠杆菌载体)，保留T-DNA的边界序列(BR和LR)。在外源基因的构建转化上，首先将外源基因构建到小质粒(如pBR322)上，然后把载有外源基因的小质粒通过一定的方法导入农杆菌，再利用Ti质粒与小质粒之间发生的同源重组，将外源基因引入T-DNA区域，形成一个共整合载体，从而形成用于转化植物细胞的一元载体转化菌株。该种系统由于在农杆菌中的整合效率较低，获得农杆菌转化菌株的效率低，使用起来不很方便。

双元载体系统包括两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒，即微型Ti质粒和辅助Ti质粒。辅助Ti质粒较大，一般是去除或者部分去除Ti质粒上的T-DNA区，保留Ti质粒上的其他部分，并保留在受体农杆菌菌体中。微型质粒只带有T-DNA边界、复制起点和选择标记基因，并在T-DNA边界中间引入多克隆位点。微型质粒既可以在大肠杆菌中复制也可以在农杆菌中复制，一般在大肠杆菌中完成目的基因的克隆。微型质粒也称为操作质粒或穿梭质粒。实际操作中只需要将载有外源基因的微型质粒引入含辅助质粒的农杆菌菌株，组成含两个质粒的农杆菌转化菌株，不需要同源重组的过程，从而提高了获得农杆菌转化菌株的效率。

在农杆菌介导的转基因操作中，下列因素影响和制约着转基因的效率:

(1)农杆菌菌株。不同的农杆菌菌株有其特异侵染的最适宿主。选择适宜的转化菌株对于提高植物转基因效率至关重要。同时，高侵染活力的菌株一般处在对数生长期。一般用A₆₀₀在1.0OD左右农杆菌菌液侵染植物材料。

(2)基因活化的诱导物。酚类化合物、单糖或糖酸、氨基酸和低pH值都影响Vir区基因的活化，在转基因操作中加入上述物质可以提高转化效率。最常用的诱导物是乙酰丁香酮(AS)。

(3)外植体的选择。选择合适的外植体是植物转基因操作成功的先决条件。对于不同的植物材料，最佳外植体的种类不同，要根据具体植物材料而定。此外，外植体的预培养与外植体的转化有明显关系，每种外植体均有其最佳预培养时间，一般以2天左右为宜。外植体的预培养可以促进细胞分裂，使受体细胞处于更容易整合外源DNA的状态。

(4)外植体与农杆菌的接种及共培养。外植体接种是指把农杆菌接种到外植体的侵染转化部位。一般是将外植体浸泡在预先准备好的农杆菌中一定时间，之后取出外植体，用无菌吸水纸吸干外植体表面的菌液，然后置于共培养基中进行共培养。共培养是农杆菌与外植体共同培养的过程。外植体与农杆菌接种时间过长或者接种菌液浓度过高，容易引起后续培养的污染;而接种时间太短或者接种菌液浓度过低，则易造成转化效率低。一般接种时间为1～30分钟，接种菌液浓度为0.5～1.0OD值左右。

农杆菌与外植体共培养是非常重要的环节。农杆菌附着、TDNA的转移和整合都在共培养时期内完成。农杆菌附着外植体表面后创伤部位生存8～16小时后才能诱发肿瘤，因此共培养的时间必须长于8～16小时。共培养时间如果太长，会由于农杆菌的过度生长而使植物细胞受到毒害而死亡。一般共培养时间为2～3天，因不同的植物和不同的共培养条件而异。

为了获得高效表达的转化载体，还需要在构建转基因载体时注意以下细节:

(1)选择恰当的转录启动子和增强子;

(2)合理的转录终止子;

(3)含有加尾信号序列;

(4)合理的非编码的引导序列和3'端拖尾序列;

(5)植物密码子的使用频率;

(6)是否需要特殊的定位序列。

为了获得真正的理想转基因植物，转化后必须进行一系列的鉴定工作:首先是筛选转化细胞，并在一定的选择压力下，诱导形成转化植株;接下来是对转化植株进行分子生物学鉴定，常用Southern杂交证明外源基因在受体染色体上整合，并检测拷贝数;染色体原位杂交(chromosome in situ hybridization，CISH)或荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)确定外源基因在染色体上的整合位点; Northern杂交证明外源基因在植物细胞中是否正常转录; Western杂交证明外源基因的正常翻译;还包括利用标记基因如GUS进行染色等鉴定分析。之后进行表型性状鉴定，确定转基因植株是否具有目标表型。最后一步是进行遗传学分析、后代目标性状的传递和稳定性分析。