方法分析基因的表达

实验二十一　Real-time PCR方法分析基因的表达

【实验目的】

1.掌握荧光定量PCR的原理及其应用。

2.学会用荧光定量PCR的方法分析目的基因在植物器官和组织中的表达。

【实验原理】

实时荧光定量PCR(real-time PCR)技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加;每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅能够实现对模板的定量分析而且具有灵敏度高、特异性和可靠性强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、实时性和准确性等特点。

定量PCR技术在1992年Higuchi等人第一次报道，他们使用EB加入PCR反应体系，然后用经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度。后来用与双链DNA有更强结合力的SYBR Green I取代EB融合荧光探针杂交技术，提高PCR的灵敏度、特异性和准确性。图2-4中是定量PCR反应的扩增曲线图，其中横坐标是扩增循环数，纵坐标是荧光强度。在定量PCR仪中每个循环进行一次荧光信号的收集。

图2-4　定量PCR反应的扩增曲线图

一般而言，荧光扩增曲线可分成三个阶段:荧光背景信号阶段(baseline region)，荧光信号指数扩增阶段(geometric phase)和平台期(platform stage)。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，因此选择在这个阶段进行定量分析。

在实时荧光定量PCR技术中有两个非常重要的概念:荧光阈值和CT值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光阈值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数被称为Ct值(threshold cycle)。Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

图2-5中Baseline粗线是背景曲线的一段，范围从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要(但还未)

图2-5　定量PCR的反应曲线

超出背景。Ct是临界循环数，为threshold横线与扩增曲线相交，所得交点对应的循环数。Threshold代表荧光超过本底，达到可检测水平时的临界数值。

荧光定量PCR过程的监测检测模式有以下几种，SYBR Green I检测模式、水解探针模式(Taqman模式)、杂交探针模式(Beacon或FRET)。几种模式的比较见表2-7。

表2-7　定量PCR的监测和检测模式

最常用的是SYBR Green I检测模式。SYBR Green I是一种能与双链DNA结合而发光的荧光染料。这种荧光染料与双链DNA结合后，荧光大幅度增强。因此，SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系中存在的双链DNA的数量。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。PCR扩增程序一般为94℃—55℃—72℃三步法，40个循环。SYBR Green I的缺点是由于SYBR Green I没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就能结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，可能会产生假阳性。SYBR Green I的优点是由于它可以和所有的双链DNA结合，所以对于不同模板不需要特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格较低，因此在科研上使用较为普遍。

目前，实时荧光PCR技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面:①基础研究中基因表达丰度、基因型和基因表达调控的研究;②临床医疗领域病原体的检测和基因诊断;③环境监测，包括水质、空气的污染检验;④检疫工作、食品卫生检验、转基因作物的检验;⑤法医的遗传学鉴定;⑥新药的开发和研究。

【实验器材】

荧光定量PCR仪，DNA电泳装置等。

【药品试剂】

SYBR Green I、Taq PCR试剂盒、RNA提取试剂盒、逆转录PCR试剂盒、特异引物等。

【实验方法】

植物总RNA的提取和逆转录:见第二部分第二节实验二十“RT-PCR方法分析基因的表达”中的步骤。

荧光定量PCR:参照《拟南芥实验手册》(Weigel and Glazebrook，2004)。

1.20μl反应体系中加入下述试剂: 0.5μl SYBR Green I、1μl逆转录产物、2×Hoststar PCR混合物(100mmol/L Tris，pH8.3，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl₂，2.5mmol/L dNTPs，1U Hoststar Taq DNA聚合酶)和引物。

【注意事项】

1.扩增子的长度应不超过400bp，理想的最好能在100～150bp。

2.长度在18～25bp之间，Tm值在58～60℃，GC含量30%～80%。

3.引物末端(最后5个核苷酸)不能有超过2个的G或C。

2.扩增

95℃2分钟

94℃10秒

54℃10秒

72℃30秒

40个循环，在低于溶解温度1℃时检测荧光。

3.溶解曲线分析

94℃1分钟

60℃1分钟

0.1℃/秒升温到92℃，连续监测荧光。

【注意事项】

PCR过程中可控制温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链DNA，SYBR Green I被释放，荧光信号减弱。以荧光信号强度对温度作图，即为熔解曲线。对熔解曲线求一阶导数，峰值代表斜率改变最大值，即T_m。T_m值是50% DNA变成单链时的温度，此温度与双链DNA的长度、GC含量有关，可部分代表序列的特异性。

4.对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特异性

5.数据的处理和结果分析

【注意事项】

简单地说，看家基因就是发育过程中任何时间、任何器官都高度表达的基因。其基因表达产物通常是对生命过程必需的或必不可少的，且较少受环境因素的影响，因此相对而言，其表达量较为恒定。适合用来做归一化比较。在研究基因表达时，往往需要在RNA水平上检测基因表达的变化，用定量PCR这种技术，使用的模板是DNA，RNA先被反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板进行定量PCR。在这个过程中，反转录的效率和模板的取量存在变化，这就需要进行归一化处理。看家基因的种类包括β-actin、16S RNA或18S RNA等。有些看家基因的表达并不是恒定的，需要选择适合的看家基因作为内参。

6.常见问题

(1)重复样品Ct值差别大，扩增效率不一致——温度均一性问题。

(2)扩增低拷贝重复性差——温度均一性问题。

(3)准确性不佳，难以区别单倍差异拷贝数——温度均一性问题。

(4)校正系统误差——光路系统问题，造成光谱重叠，导致检测不准确。

【思考题】

1.简述荧光定量PCR的原理和应用。

2.试设计实验分析植物中某种基因在不同组织中的表达情况。