原位杂交技术

原位杂交技术_植物发育生物学实

实验二十二　mRNA原位杂交技术

【实验目的】

1.掌握植物mRNA原位杂交技术的原理和基本操作步骤。

2.初步掌握独立设计实验中所用的探针，学习并完成杂交实验。

【实验原理】

原位杂交(in situ hybridization)是一种在细胞水平上研究基因表达调控的最有效的分子生物学技术。这一技术最初应用于动物染色体上的基因物理定位和特定mRNA在组织中的空间定位，后来又作为诊断工具检测感染病毒的细胞。20世纪80年代后期，原位杂交技术开始应用于植物基因表达调控的研究。RNA原位杂交是用同位素标记或非同位素标记的双链DNA或单链反义RNA探针对组织切片或装片的不同细胞中基因产物mRNA或rRNA进行原位定位。分布于细胞中的mRNA与反义RNA探针互补而杂交产生双链的RNA。标记在反义链上的同位素经放射自显影、非同位素经酶促免疫显色或免疫荧光反应，均可显示mRNA在植物组织细胞中的分布位置。用标记的有义RNA作探针，由于与细胞内的mRNA不互补而不能杂交，可以作为对照。

RNA原位杂交的操作流程为(以组织切片和DIG标记RNA探针为例):材料固定与包埋→制片→质粒DNA线性化→DIG标记的体外转录→预杂交→杂交→杂交后处理→免疫反应→显色反应→封片观察。

RNA原位杂交技术从一开始就主要用于特异基因表达的空间定位，不但用于正常植物各个器官组织发育而且用于体外培养器官发育的基因表达定位。非特异表达基因虽然没有器官组织的表达特异性，但在植物发育过程中的不同阶段有着表达量的时空差异。RNA原位杂交技术也用于非特异基因的表达定位。当前，RNA原位杂交技术应用最广泛的方面是结合其他技术对分离的基因进行分析。在结合RNA原位杂交技术分析分离基因的功能方面已积累了相当丰富的资料。RNA原位杂交技术还可以用于外源基因在转基因植物中的定位以及外源刺激引起的基因表达定位。

RNA原位杂交技术能够确定细胞甚至亚细胞水平的基因表达的时空特征，对于植物生长代谢、成花过程、受精与胚胎发生等生命活动中的基因表达调控机制提供直接的资料。RNA原位杂交技术还能与其他分子生物学技术、显微操作技术、免疫学技术等结合深入研究基因的结构、功能和表达的调控机制。RNA-RNA原位杂交技术以其RNA探针的标记效率高、通透性强、结合稳定、杂交信号强等优势，已被广泛应用于植物和动物组织的基因时空表达研究。

【实验材料】

水稻不同组织和器官。

【实验器材】

恒温培养箱，石蜡切片机，烘箱，低温冷冻离心机，水浴锅，镊子，载玻片，盖玻片，显微镜等。

【药品试剂】

具体见实验方法部分。

【注意事项】

在操作过程应尽量避免RNase污染，耐高温器皿180℃烘烤8小时以上，其他器皿用氯仿冲洗，溶液用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)处理或DEPC-H₂ O(DEPC处理过的蒸馏水)配制，DEPC是一种RNAase强烈抑制剂。

【实验方法】

一、组织材料的固定

水稻(Oryza sativa L.)组织用4%多聚甲醛固定，常规酒精系列脱水与石蜡切片，切片厚度约为10μm。

二、载玻片的处理

将洁净的载玻片放在10mmol/L的Tris-HCl(pH8)配制的100μg/m l多聚赖氨酸(Sigma)溶液中浸泡30分钟以上，取出后自然晾干备用。

三、材料的固定、脱水、包埋与切片

参考Lin等(1986)和Cheng等(1996)的方法。所用水稻(Oryza sativa L.)材料为粳稻品种IR62266。取7日龄水稻幼苗的根、三叶期幼苗的叶、拔节期幼苗的茎及开花前后植株的花药和雌蕊，于1×PBS(0.135mol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，1.5mmol/L KH₂ PO₄，8mmol/L Na₂ HPO₄，pH 7.4)配制的4%多聚甲醛中4℃下固定过夜。为了确定不同发育时期的花药中小孢子母细胞及花粉的发育时期，将取材的每个水稻颖花取出一个花药压片镜检确定时期，对于难以确定的二细胞和三细胞花粉可以用DAPI染色鉴定时期。材料固定后，用PBS洗3次，每次10分钟。叔丁醇七步系列脱水(Tanimoto和Rost，1993)，每一级10～12小时。最后一级脱水后将材料转入新的100%叔丁醇中，于58～60℃烘箱中逐渐加入碎石蜡(paraplast plus，Sigma)开始浸蜡，3～4小时加入1次，开始加入的量少些，为叔丁醇总体积的5%～10%。浸蜡约2天后将材料转入100%石蜡进行包埋。石蜡块修块后用切片机切成厚度为8～10μm的连续切片;将切片粘片于预涂过多聚赖氨酸的载玻片上，45℃烘干12小时以上，备用。

四、探针的制备

1.质粒DNA线性化

①在离心管中加入表2-8中的成分。限制性内切酶的选择需要根据构建在载体上的基因序列决定，这里以Sac I为例。

表2-8　质粒DNA线性化反应体系

②37℃保温2小时以上。

③消化液用酚∶氯仿(1∶1)抽提，12000r/min，4℃，离心5分钟。

④上清液用0.1倍体积3mol/L乙酸钠(pH 5.2)和2倍体积乙醇沉淀过夜。

⑤12000r/min，4℃离心20分钟。

⑥沉淀用70%乙醇洗涤1次，真空干燥。

⑦将线性化质粒按1μg/μl重悬于DEPC-H₂ O中，－20℃以下保存;取2μl点样电泳，检测线性化纯度。

2.地高辛标记的体外转录

①在冰上按顺序加入表2-9中所示样品和试剂。

表2-9　地高辛标记的体外转录

②轻轻混匀和离心后，37℃保温2小时。

③加入2μl无RNase的DNase I，37℃保温15分钟。

④加入2μl 0.2mol/L EDTA终止反应。

⑤加入2.5μl 4mol/L LiCl和75μl冰冷的100%乙醇，沉淀过夜。

⑥12000r/min，4℃离心15分钟。

⑦用70%冷乙醇清洗，真空干燥。

⑧根据沉淀物的多少(一般为6～10μg)，重悬于30～50μl DEPC-H₂O中，并加入20 U RNase抑制剂，－20℃保存。

五、预杂交

1.将已粘片的石蜡切片在二甲苯中脱蜡30分钟。

2.在二甲苯∶乙醇(1∶1)、100%乙醇、95%乙醇、70%乙醇、30%乙醇和DEPC-H₂O中复水，每级2～5分钟。

3.在0.2mol/L HCl中浸20分钟。

4.在2×SSPE中洗2次，DEPC-H₂ O中洗2次，每次5分钟。

5.在含有1%牛血清白蛋白的10mmol/L Tris-HCl(pH 8)中浸10分钟。

6.DEPC-H₂ O中洗2次，每次5分钟。

7.经30%，70%，95%，100%乙醇系列脱水，每次2～5分钟，室温晾干。

六、杂交

1.杂交缓冲液和探针体积计算

①地高辛标记的转录物体积TV(μl)= 0.5μl/片×(片数+1)

②杂交液的终体积FV(μl)=(片数+ 1)×100μl/片

③转录物稀释液体积DB(μl)=(0.2×FV)－TV

④杂交缓冲液体积HB(μl)=0.8×FV

2.溶液配制

①转录物稀释液: 50%甲酰胺

10mmol/L二硫苏糖醇(DTT)

用DEPC-H₂O定容

②10×盐: 3mol/L NaCl

0.1mol/L Tris-HCl(pH 6.8)

0.1mol/L Na₂ HPO₄(pH 6.8)

50mmol/L EDTA

溶于DEPC-H₂O

③杂交缓冲液(表2-10):

表2-10　杂交缓冲液配方(每1ml)

④20×SSPE:(每100ml) 17.53g NaCl，2.76g NaH₂ PO4·H₂ O，0.74g EDTA，10mol/L NaOH调至pH7.4，115℃高压灭菌15分钟。

⑤20×SSC:(每100ml) 17.53g NaCl，8.82g柠檬酸钠，10mol/ L NaOH调至pH 7，115℃高压灭菌15分钟。

⑥磷酸缓冲液PBS:(每1000ml) 8g NaCl，0.2g KCl，1.44g NaH₂ PO₄，0.24g KH₂ PO₄，调至pH7.4，115℃高压灭菌15分钟。

3.杂交

①将转录物用稀释液稀释。

②70℃加热5分钟，再加入杂交缓冲液。

③每玻片上加杂交液100μl，轻轻盖上经180℃烘烤8小时以上的盖玻片。

④在湿盒中60℃保温过夜(12～16小时)。

4.杂交后处理

①让盖玻片在2×SSC中自由滑落，室温浸泡15分钟。

②转入另一2×SSC中浸泡15分钟。

③1×SSC中15分钟。

④0.5×SSC中15分钟。

七、免疫反应

1.在缓冲液I(100mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，pH 7.5)中5分钟。

2.每片滴加约500μl含2%正常兔血清，0.3% Triton X-100的缓冲液I，室温放置30分钟，作封阻反应。

3.将anti-DIG-AP按1∶500的比例用含1%正常兔血清，0.15% Triton X-100的缓冲液稀释。

4.倒掉封阻液，每片滴加100μl稀释的anti-DIG-AP，室温条件下，在湿盒中放置2～4小时。

八、显色反应

1.玻片在缓冲液I中浸2次，每次15分钟。

2.缓冲液Ⅱ(100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，50mmol/L MgCl₂，pH 9.5)中5分钟。

3.将10%聚乙烯醇(PVA) 90℃溶于100mmol/L Tris-HCl(pH 9.5)，100mmol/L NaCl中，冷却至室温后，每ml PVA溶液中加50μl 1mol/L MgCl₂，5μl氮蓝四唑(NBT)，3.75μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(BCIP)配成显色液。

4.每片滴加200μl显色液，置湿盒中37℃黑暗处显色6～12小时。

九、封片观察

1.将载玻片转入缓冲液Ⅲ(10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8)中，浸5分钟，终止反应。

2.另一缓冲液Ⅲ中浸5分钟。

3.经30%、75%、95%、100%乙醇、二甲苯:乙醇(1∶1)和二甲苯系列脱水透明，用阿拉伯树胶封片。

4.显微观察组织细胞中有蓝色沉淀物为阳性反应。图2-6显示的是某个基因在烟草花发育不同时期的表达情况。

【思考题】

1.mRNA原位杂交中需要注意的事项有哪些?

2.在预杂交中，HCl和BSA等试剂的功能是什么?为什么要进行预杂交的工作?

3.如何避免实验中的假阳性现象?

4.如何选择合适的探针?