基因枪法转化洋葱表皮细胞

实验二十九　基因枪法转化洋葱表皮细胞

【实验目的】

1.通过本实验使学生掌握基因枪法的原理及方法。

2.了解GFP报告基因在分析蛋白质细胞定位方面的原理、方法和应用。

【实验原理】

1987年克莱因(Klein)等首次用基因枪轰击洋葱上表皮细胞，成功地将包裹了外源DNA的钨弹射入组织细胞内，并实现了外源基因在组织细胞中的表达。这一方法需要使用一种模仿枪结构的装置——基因枪，枪管的前端是封口的，上面只有直径1mm的小孔，弹头不能通过。其具体操作是将直径4μm左右的钨粉或其他重金属粉在外源DNA中形成悬浮液，则外源DNA会被吸附到钨粉颗粒的表面;再将这些吸附外源遗传物质的金属颗粒装填到圆筒状弹头的前端;起爆后，弹头加速落入枪筒，在枪筒口附近被挡住，而弹头前端所带的钨粉颗粒在惯性作用下脱离弹头，以高速通过1mm的小孔直接射入受体细胞，其表面吸附的外源DNA也随之进入细胞内。也可以用高压放电或高压气体使金属粒子加速。这一方法与微注射法相比，具有一次处理可以使许多细胞转化的优点，受体可以是植物组织也可以是细胞。应用此方法已获得了玉米、小麦、水稻的转化细胞和烟草、大豆等可育的转化植株。另外，也有对未成熟胚进行轰击并实现转化的研究报道。

基因枪法的优点:①无宿主限制。基因枪法本质上是一种物理过程，没有宿主限制，对单子叶和双子叶植物都能进行有效转化。②靶受体类型广泛，不受组织类型限制。几乎所有具有潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰击转化。目前用于基因枪转化的受体材料十分广泛，其中包括原生质体、悬浮细胞、根或茎的切段、叶圆片、成熟胚、幼胚、分生组织、愈伤组织、胚芽鞘等几乎所有具有潜在分化能力的组织或细胞。③可控度高。采用高压放电或高压气体驱动的基因枪，可根据实验需要，将载有外源DNA的金属颗粒射入特定层次的细胞(如再生区的细胞)，使转化细胞能再生植株，从而提高转化频率。④操作简便且快速。基因枪法是一种物理过程，只要在无菌的条件下将载有外源基因的金属颗粒轰击受体材料，就可以进行筛选培养，因此它的操作简便而迅速。

基因枪法的缺点:由于基因枪轰击的随机性，外源基因进入宿主基因组的整合位点相对不固定，拷贝数往往较多，这样转基因后代容易出现突变、外源基因容易丢失，容易引起基因沉默等现象，不利于外源基因在宿主植物的稳定表达。而且基因枪价格昂贵、运转费用较高。

绿色荧光蛋白GFP是从发光水母中分离的一种绿色荧光蛋白，其分子量很小;当与其他蛋白质融合后仍可保持其生物活性，因此，用于检测能与之融合的某一特定蛋白质的表达与定位。

【实验材料】

洋葱，构建成功的瞬间表达载体质粒和对照质粒。

【实验器材】

光照培养箱、基因枪、超净工作台、荧光显微镜、其他小型分子生物学仪器等。

【药品试剂】

金粉。

【实验方法】

一、金粉的准备

1.称取30mg的金粉，置于1.5ml的离心管中。

2.加入1ml 70%乙醇并充分混匀2～3分钟。将金粉浸泡在70%乙醇中15分钟，之后离心5秒钟将金粉沉淀下来，并将上清液倒掉。

3.重复3次下面的清洗步骤:加入1ml无菌水，振荡1分钟，之后让金粉自然沉降1分钟，并短暂离心，将上清液去掉。

4.清洗后，加入500μl50%甘油使金粉的浓度为60mg/ml。每次轰击使用500μg，即8～9μl。制备好的金粉悬浮液可以在室温保存2个星期。如果使用的是钨，则需要在－20℃保存，避免金属钨被氧化。

二、DNA的处理

1.将准备好的金粉悬浮液(50%甘油，浓度为60mg/ml)振荡5分钟，使聚合的颗粒散开。

2.取50μl(3mg)金粉的悬浮液到一个新的1.5ml离心管中。按照顺序加入下列物质: 5μl DNA(1μg/μl); 50μl 2.5mol/L CaCl₂; 20μl 0.1mol/L亚精胺(组织培养级)。

3.将上述物质混匀2～3分钟，将离心管静止约1分钟，然后在离心机上点离5秒钟，之后将上清液去掉。

4.在沉淀部分加入140μl 70%乙醇，混匀后在离心机上点离5秒钟，然后去掉液体部分;再加入140μl 70%乙醇，混匀后在离心机上点离5秒钟，去掉液体部分;最后加入48μl 100%乙醇。将沉淀轻轻重悬。

三、基因枪注射和显微观察

1.撕取洋葱表皮，放在MS固体培养基(3%蔗糖，1%琼脂粉)上。

2.开启超净工作台，使其正常工作。

3.打开基因枪电源，打开氮气瓶气阀，将VCA/VENT键打到VENT位置，待气压表指针到达设定位置后，将VCA/VENT键调到中间hold位置，按住Fire键，直到发射。使VCA/VENT键到VCA位置，使气压恢复正常;关闭氮气瓶气阀;关闭基因枪气阀。不同型号的基因枪的操作稍有不同，但是原理基本相同。

4.将注射过的洋葱表皮放置在室温下，持续光照培养20～24小时，荧光显微镜(488nm)下观察GFP荧光。实验结果如图3-11所示。

【思考题】

1.除GFP可以作为报告基因外，还有哪些基因可以作为报告基因?各有什么优缺点?

2.利用基因枪进行转基因操作与农杆菌介导的转基因方法各有什么优点和局限性?

图3-11　显示GFP在洋葱表皮细胞中的表达情况