植物培养基的配制

植物培养基的配制_植物发育生物学实

实验三十三　植物培养基的配制

【实验目的】

1.了解植物组织培养基的组分及其作用。

2.学习和掌握植物组织培养基的配制方法。

【实验原理】

培养基是植物组织培养中离体组织赖以生存和发育的基本条件。大多数培养基的成分是由无机盐、有机化合物(碳源、维生素、肌醇、氨基酸等)、生长调节物质、水分和其他附加物等五大类物质组成。

无机盐类由大量元素和微量元素两部分组成。大量元素中，氮源通常有硝态氮或/和铵态氮，但在培养基中多用硝态氮，也可将硝态氮和铵态氮混合使用;磷和硫常用磷酸盐和硫酸盐来提供;钾是培养基中主要的阳离子;钙、钠、镁的需要量较少。微量元素包括碘、锰、锌、钼、铜、钴和铁。培养基中的铁离子，大多以螯合铁的形式存在，即FeSO₄与Na₂-EDTA(螯合剂)的混合。

有机化合物包括碳源、维生素、肌醇、氨基酸等。培养中植物组织和细胞的光合作用较弱，因此，需要在培养基中附加一些碳水化合物以供营养需要。培养基中的碳水化合物通常为蔗糖。蔗糖除作为培养基内的碳源和能源外，对维持培养基的渗透压也起着重要作用。在培养基中加入维生素有利于细胞的分裂和生长。一般包括维生素B1、维生素B6、烟酸、生物素、叶酸、泛酸钙和维生素C。肌醇在糖类的相互转化、维生素和激素的利用等方面具有重要的促进作用。

常用的植物生长调节物质包括以下三类:①生长素类:吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)等。②细胞分裂素:玉米素(ZT)、6-苄基嘌呤(6-BA或BAP)和激动素(KT)。③赤霉素:组织培养中使用的赤霉素只有一种，即赤霉酸(GA₃)。

培养基中的其他附加物包括人工合成和天然的有机附加物。其中，最常用的有酪朊水解物、酵母提取物和椰子汁等。琼脂作为培养基的支持物，也是最常用的有机附加物，它可以使培养基呈固体状态，以利于组织和细胞培养。

植物组织培养是否成功，在很大程度上取决于培养基的选择。不同培养基具有不同的成分和含量，具有不同的特点，适合于不同的植物种类和材料的培养。具体的培养基配方见附件。

目前普遍使用的是MS培养基。MS培养基是1962年穆拉希吉克(T.Murashige)和斯科克(F.Skoog)为培养菸草材料而设计的。它具有较高的无机盐浓度，对保证组织生长所需的矿质营养和加速愈伤组织的生长十分有利。MS固体培养基可用来诱导愈伤组织，或用于胚胎、茎段、茎尖及花药培养等，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显效果。一般情况下，无需添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有机附加成分。MS培养基的硝酸盐、钾和铵的含量略高于其他培养基，也是它被普遍使用的原因之一。

B5培养基的主要特点是含有较低的铵，因为铵可能对某些培养物的生长具有抑制作用。

N6培养基特别适合于禾谷类植物以及花药和花粉培养。

在组织培养中，经常采用的还有While培养基(1963)、Nitsch培养基(1951)、Km8p培养基(1977)等。While培养基由于无机盐的含量较低，适合木本植物和根的组织培养; Km8p培养基的营养成分丰富，适合于植物原生质体培养。

在配制培养基前，为了使用方便和用量准确，常常将大量元素、微量元素、铁盐、有机化合物、激素类等分别配制成比培养基配方含量大若干倍的母液。当配制培养基时，只需要按预先计算好的量吸取母液即可。

【实验器材】

分析天平(精确度为0.0001g)、天平(精确度为0.01g)、烧杯(500ml，100ml，50ml)、容量瓶(1000ml，100ml，50ml，25ml)、试剂瓶(1000ml，100ml，50ml，25ml)、药勺、玻璃棒、电炉、高压灭菌锅等。

【药品试剂】

NH₄ NO₃，KNO₃，CaCl₂·2H₂ O，MgSO₄·7H₂ O，KH₂ PO₄，KI，H₃ BO₃，MnSO₄·4H₂ O，ZnSO₄·7H₂ O，Na₂ MoO₄·2H₂ O，CuSO₄·5H₂ O，CoCl₂·6H₂ O，FeSO₄·7H₂ O，Na₂ EDTA·2H₂ O，肌醇，烟酸，盐酸吡哆醇(维生素B₆)，盐酸硫胺素(维生素B₁)，蔗糖，甘氨酸，琼脂等。

【实验方法】

1.培养基母液的制备

①大量元素母液:各成分按照表4-1培养基浓度含量扩大10倍，用天平称取后，用蒸馏水分别溶解，按顺序逐步混合。之后用蒸馏水定容到1000ml，即为10倍的大量元素母液。贴好标签保存于4℃冰箱中。每配1L培养基取此液100ml。

表4-1　MS培养基大量元素母液制备

【注意事项】

配制大量元素母液时，某些无机成分如Ca²⁺、SO₄²－、Mg²⁺和H₂ PO^4－等在一起可能发生化学反应，产生沉淀物。为避免此现象发生，母液配制时要用双蒸水溶解，药品采用分析纯，各种化学药品必须分开配制，即先以少量双蒸水使其充分溶解后才能混合。混合时应注意先后顺序，特别应将Ca²⁺，SO₄²－，Mg²⁺和H₂ PO^4－等离子错开混合，速度宜慢，边搅拌边混合。CaCl₂·2H₂ O溶液在所有的试剂溶解后单独加入混合。

②微量元素母液: MS培养基的微量元素由7种化合物(除Fe以外)组成，具体见表4-2。用蒸馏水定容至1000m l，即为100倍的微量元素母液。配1L培养基，取微量元素母液10ml。称取药品时应使用精确度为0.0001g的分析天平，以确保培养基中微量元素的精确性。

表4-2　MS培养基微量元素母液的配制

③铁盐母液:常用的铁盐是硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠的螯合物，必须单独配成母液。这种螯合物使用起来方便，又比较稳定，不易发生沉淀。按照表4-3中的量称取硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠，用蒸馏水加热溶解。配制1L培养基时取此液10ml。

表4-3　MS铁盐母液的配制

【注意事项】

在配制铁盐时，如果加热搅拌时间过短，会造成FeSO₄和Na₂ EDTA螯合不彻底，此时若将其冷藏，FeSO₄会结晶析出。为避免此现象发生，配制铁盐母液时，FeSO₄和Na₂ EDTA应分别加热溶解后混合，并置于加热搅拌器上不断搅拌至溶液呈金黄色(加热20～30分钟)，调pH值至5.5，室温放置冷却后4℃冰箱中冷藏。

④有机成分母液: MS培养基的有机成分有甘氨酸、肌醇、烟酸、盐酸硫胺素和盐酸吡哆素等(表4-4)。有机化合物母液营养丰富，储藏时易染菌，因此，配制母液时用无菌重蒸水溶解，并储存在棕色无菌瓶中，或缩短储藏时间。有机成分一般也是过滤除菌保存。一般情况下，表4-4中1～4序号的4种有机化合物配制为同一母液，肌醇因用量大而单独配置。用蒸馏水定容至1000ml，即为100倍母液。配1L培养基，取该母液10ml。经过滤除菌后，于4℃冰箱中保存。

表4-4　MS培养基有机物质母液的制备

续表

⑤激素母液:植物组织培养中使用的激素种类及含量需要根据不同的研究目的而定。一般配制激素母液的终浓度以0.5～1.0 mg/ml最为适宜，需要注意的是:配制生长素类激素，例如IAA，NAA，2.4-D和IBA，应先用少量95%乙醇或无水乙醇充分溶解，或者用1mol/L的NaOH溶解，然后用蒸馏水定容。细胞分裂素，例如KT、6-BA和ZT，应先用少量95%乙醇或无水乙醇加少许1mol/L盐酸溶解，再用蒸馏水定容。生物素先用稀氨水溶解，然后定容。所有的母液保存于4℃冰箱中，若母液出现沉淀或霉团则不能继续使用。

2.培养基的配制

①计算:根据配制培养基的量和母液的浓度计算需要吸取母液的量(表4-5)。

表4-5　按配方计算各种母液吸取量

②移液和称取:按照计算量依次吸取各母液置于烧杯中;称取适量的蔗糖，置于烧杯中。

③融化:称取适量的琼脂粉(0.8%)置于另一烧杯中，加入适量的双蒸水，电炉上加热融化;

④混匀:将融化的琼脂与试剂和溶液混合，按量定容。

⑤调节pH值:用滴管吸取1mol/L的NaOH或HCl溶液，逐滴滴入融化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用精密的pH试纸(5.4～7.0)或者pH计测量培养基的pH值，直到培养基达到pH 5.8～6.0为止。

⑥分装:烧杯中的培养基100ml倒入500ml锥形瓶中，即培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。如果是液体培养基则不需要加入琼脂粉即可。

⑦包扎:用透气膜封口，外边加一层牛皮纸，扎好绳子，用铅笔在纸上写上培养基名称和各组编号。

【注意事项】

培养基的部分成分在高温灭菌时易发生化学变化，致使培养基pH值降低，从而使琼脂凝固力下降，出现培养基灭菌前凝固，灭菌后不凝固现象。避免此现象发生的方法是:调整培养基的pH值，一般不低于5.6，酸性较强的培养基可适当增加琼脂用量。

3.培养基的灭菌

培养基中含有大量的有机物，含糖量较高，是各种微生物滋生、繁殖的良好场所。植物组织需要在无菌条件下培养很长时间，如果培养基被污染，则达不到培养的预期结果。因此，培养基的灭菌是植物组织培养中十分重要的环节。常用的灭菌方法是高压灭菌和过滤除菌。

①高压蒸汽灭菌法

把分装好的培养基、各种接种器具、蒸馏水等，放入高压蒸汽灭菌锅的消毒桶中，锅内外层加水，水位高度不超过支架高度，盖好锅盖。加热后，锅上压力表指针开始移动，当压力到达0.05Mpa(即指针移至0.5kg/cm²，约7.25磅/平方英寸，此时温度约为110℃)时，扭开放气阀排除空气，使压力表指针回复零位。当压力到达0.108Mpa(即指针移至1.1kg/cm²，约15磅/平方英寸时，此时温度约为121℃时)时，维持一定的时间。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所以灭菌的时间也不同，具体可以参考表4-6。到达保压时间后，即可切断电源，如压力达到0.05MPa，可缓慢放出蒸汽，应注意不要使压力降低太快，以免引起激烈的减压沸腾，使容器中的液体溢出。当压力降到零后，才能开盖，取出培养基和实验工具，摆放于实验台上，冷凝备用。注意不可长久不放气，这会引起培养基成分变化。目前，多数实验室采用的是全自动高压蒸汽灭菌锅，灭菌前调整所需参数，灭菌开始后自动完成整个灭菌过程，十分方便。

表4-6　培养基高压蒸汽灭菌所需最短时间

【注意事项】

1.通常饱和蒸汽压力与其对应的温度具有一定的关系。即0.05Mpa≈0.5kg/cm²≈7.25磅/平方英寸，此时温度约为110℃; 0.07Mpa≈0.7kg/cm²≈10磅/平方英寸，此时温度约为115℃; 0.108Mpa≈1.1kg/cm²≈15磅/平方英寸，此时温度约为121℃。

2.三角瓶中的液体不超过总体积的60%，否则当温度超过100℃时，培养基会喷溢，造成培养瓶壁和封口膜的污染。

3.高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%～20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%～25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基pH值小于5.5，其水解量更多。一般在培养基中为蔗糖或者葡萄糖时，可适当将灭菌的温度和时间降低，防止蔗糖水解和葡萄糖遭受破坏。

②过滤除菌

培养基中有些成分是热不稳定性的物质，在高温湿热灭菌中可能会降解。因此，这类物质需要进行过滤灭菌。例如生长素IBA、赤霉素、玉米素、脱落酸、尿素、某些维生素、酶液等是不耐热的，容易在高温下分解，因此不适宜高压灭菌处理，而通常采用过滤灭菌方法。除菌滤膜其孔径大小一般小于或等于0.25μm。

过滤灭菌的原理是溶液通过滤膜时，细菌和孢子等由于细胞直径大于滤膜孔径而被阻隔。在需要过滤灭菌的液体量大时，可使用抽滤装置;液体量少时可用注射过滤器，它由注射器和过滤器(中间夹有微孔滤膜)组成。注射器不必先经高压灭菌，而过滤器和微孔滤膜要预先用铝箔或牛皮纸等包扎，经高压灭菌后方可使用。在使用前按无菌操作要求将吸有需过滤溶液的注射器和过滤器装配在一起，推压注射器活塞杆，将溶液压过滤膜，从针管前端滴出的溶液即为无菌溶液，无菌溶液可分装在已灭菌的离心管或玻璃瓶中备用。滤膜不能阻挡病毒粒子通过，在一般情况下，人工配制的溶液不会含有使植物致病的病毒。如需过滤灭菌的溶液带有沉淀物，那么在过滤灭菌之前可用滤纸先予以去除，这样可减少微孔滤膜被堵塞的情况。

4.倒平板

将灭菌后的培养基置于超净工作台上，待冷却到50℃左右时，倒入事先已灭好菌的平皿中。为了避免培养基在凝固过程中产生的蒸汽冷凝回流到培养基上，可以在超净工作台上将培养皿的盖子半打开、风干。待培养基冷却后，即可接种培养材料。如果不是立即使用，可以将装有培养基的培养皿用封口膜封好，于4℃冰箱中保存、备用。

【思考题】

1.简述植物组织培养基中各组分的作用。

2.配制植物组织培养基的注意事项有哪些?