烟草小孢子发育过程的观察

实验三十八　烟草小孢子发育过程的观察

被子植物的个体发育包括营养器官(根、茎、叶)和生殖器官(花器官)的发育两个阶段。花器官形成、授粉、受精及胚胎发育是被子植物个体发育中极其重要的事件，它使植物个体得以遗传和延续。在这一有性生殖过程中，发生着一系列的生理代谢、基因调控等多个层次、不同水平的时空变化，最终体现出生殖器官的形态结构、发育进程的差异。因此，学习和掌握被子植物花器官的发生及形态、大小孢子及雌雄配子体的发生与发育过程、精卵细胞的形成及特点、授粉、受精及胚胎发育等生殖发育中的基础理论知识和实际应用，无疑是研究和探讨有性生殖过程中关键事件及分子机理的重要前提和基础。

【实验目的】

利用直接压片法学习和观察烟草小孢子发育的过程。

【实验原理】

花药内花粉母细胞(小孢子母细胞)经减数分裂由一个细胞形成4个细胞(四分体)。每个细胞就是一个单倍的小孢子(单核花粉)，它的进一步发育是进行二次有丝分裂，形成1个大细胞中包含3个核的雄配子体。首先是单核小孢子的核由于细胞质液泡化，被大液泡挤压到萌发孔相对的一边，这就是所谓的单核靠边期，紧接着进行第一次有丝分裂，成为二核花粉，其中稍大的一个为营养核，较小的一个为生殖核;第二次有丝分裂是生殖核分裂，形成2个精细胞。这样就形成有三个核的花粉(雄配子体)。植物的种类不同，第二次有丝分裂的时间是不同的，一些植物在开花、授粉之前只进行一次有丝分裂，仅发育到二核花粉时期，生殖核的分裂是授粉之后花粉管萌发、生殖核进入花粉管后才进行的。在较多情况下小孢子沿配子体途径从单核小孢子发育成三核的雄配子体。

【实验材料】

不同时期的烟草花药。

【实验器材】

普通光学显微镜，镊子，载玻片和盖玻片等。

【药品试剂】

15%蔗糖水溶液。

【实验方法】

一、切片观察

该种方法可以观察到不同时期花药发育的形态和细胞特征。

1.取不同发育时期的花药进行固定、脱水、石蜡包埋、切片。

2.切片观察。

二、压片观察该方法一般用于快速观察小孢子母细胞、四分体时期、单核小孢子、二核花粉、成熟花粉等发育过程。

1.取不同发育时期的花药，置于载玻片上。

2.滴加15%蔗糖溶液(保证合适的渗透压)在载玻片上，用小镊子将花药捣碎。

3.小心取出组织碎片，加上盖玻片后在普通光学显微镜下观察。

【图解】

1.花药的发育

花药是雄蕊产生花粉的结构，由花粉囊(pollensac)和药隔(connective)组成。多数植物的花药有4个花粉囊，少数种类如锦葵科植物的花药只有2个花粉囊。花粉囊是产生花粉(pollen grain)的囊状结构，药隔是花药中部连接花粉囊的部分。药隔由通入花丝的维管束和周围的薄壁细胞组成。

雄蕊原基经顶端生长和边缘生长基本完成幼嫩花药的发育。幼嫩花药最初为一团分生组织，外面为一层原表皮，垂周分裂将来形成花药的表皮(见图5-1中的L1);中间是基本分生组织，参与药隔和花粉囊的发育(见图5-1中的L2);原基的近中央部分为原形成层(见图5-1中的L3)，将来形成药隔和维管束，与花丝维管束相连。

图5-1　花药的发育(网络资源)

幼嫩花药经细胞分裂而逐渐长大，由于4个角落处的细胞分裂较快，横切面上由近圆形变成四棱形。以后在四棱处原表皮层下面的第一层基本分生组织细胞分化成为多列的孢原细胞(archesporial cell)，其细胞较大，核大、质浓，分裂能力较强。孢原细胞进行平周分裂，形成内外两层，外层为初生壁细胞，内层为造孢细胞(primary sporogenous cell)。初生壁细胞继续进行平周分裂和垂周分裂，自外向内逐渐形成药室内壁(endothecium)、中层(middle layer)和绒毡层(tapetum)，与表皮(epidermis)一起构成花粉囊壁。药室内壁常为一层细胞，初期常储藏大量的淀粉和其他营养物质;中层由一至数层较小而扁平的细胞组成，并有大量的淀粉等营养物质;绒毡层是花粉囊壁的最内一层细胞，其细胞较大，初期为单核，中期可形成多核细胞。绒毡层细胞质浓，细胞器丰富，含较多的RNA及蛋白质以及丰富的油脂和类胡萝卜素等营养物质和生理活性物质，对小孢子的发育和花粉粒的形成起重要的营养和调节作用。初生造孢细胞经有丝分裂或不经过有丝分裂发育成花粉母细胞。在花药成熟过程中，花粉母细胞经减数分裂，发育成花粉粒。

花药中部的原形成层细胞逐渐分裂、分化形成维管束，和其他基本分生组织发育来的薄壁细胞一起构成药隔。

表皮为整个花药的最外一层细胞，以垂周分裂增加细胞数目以适应内部组织的生长。

2.拟南芥花药发育的形态和细胞特征

拟南芥花药发育根据形态和细胞特征分为14个时期(图5-2，stage1-14)。

第1时期的形态特征表现为圆形雄蕊原基的出现，此时分为分生组织L1、L2和L3三层细胞。

第2时期的形态特征表现为在L2层的4个角出现孢原细胞，孢原细胞较大、细胞核大、细胞质浓厚;雄性原基的形状变为椭圆形;此时花药中包括表皮和孢原细胞等。

第3时期开始出现4个有丝分裂活跃的区域，从孢原细胞产生一个壁细胞层和一个造孢细胞层，每一层进一步的分裂各自产生两层壁细胞和两层造孢细胞。此时的花药存在的组织包括表皮、壁细胞和造孢细胞。

在第4时期时，出现了4个浅裂的花药并产生两个发育的气孔区，维管束区开始发育。存在的组织包括表皮、内皮、中层、绒毡层、造孢细胞、药隔、维管束等。

第5时期已经有4个清晰的花药腔室形成，存在所有花药细胞类型，花药的模式已经限定，小孢子母细胞开始出现。存在的组织包括表皮、内壁、中层、绒毡层、小孢子母细胞、药隔、维管束等。

第6时期时，小孢子母细胞进入减数分裂，中层被压碎并退化，绒毡层开始液泡化，花药全面扩大。存在的组织包括表皮、皮层、中层、绒毡层、小孢子母细胞、药隔、维管束等。

第7时期的形态特征表现为减数分裂完成，小孢子四分体自由地存在于花粉囊中，存在残余的中层。存在的组织包括表皮、皮层、中层、绒毡层、四分体、药隔、维管束等。

在第8时期时，包围四分体的胼胝质壁退化，从四分体释放单个小孢子。存在的组织包括表皮、皮层、绒毡层、小孢子、药隔、维管束等。

第9时期的主要特征是花药继续生长和膨大，小孢子产生花粉粒外壁并液泡化，在电镜下可看到隔膜。存在的组织包括表皮、皮层、绒毡层、小孢子、药隔、维管束、隔膜等。

第10时期时，绒毡层开始退化。存在的组织包括表皮、皮层、绒毡层、小孢子、药隔、维管束、隔膜等。

C: connective，药隔; E:表皮; En:皮层; ML:中层; MSp，microspore，小孢子; PG: pollen grain，花粉粒; St，stomium，气孔; T:绒粘层; Tds: tetrads，四分体; V: vascular，维管束。

图5-2　拟南芥花药发育形态和细胞特征(网络资源)

第11时期的特征是花粉发生有丝分裂，绒毡层退化，内层膨胀，在内层和药隔出现次级纤维加厚，隔膜细胞开始退化，气孔开始分化。存在的组织包括表皮、皮层、绒毡层、花粉粒、药隔、维管束、隔膜、气孔等。

第12时期的代表性特征是含有3细胞花粉粒的花药，气孔下面隔膜退化和损坏后花药变为两个腔室，电镜下可看到气孔。存在的组织包括表皮、皮层、花粉粒、药隔、维管束、气孔等。

第13时期的花粉囊沿着气孔裂开并释放花粉。存在的组织包括表皮、皮层、花粉粒、药隔、维管束等。

到第14时期，雄蕊衰老，细胞和花药结构收缩。存在的组织包括表皮、皮层、药隔、维管束等。

图5-3　ELAYED-DEHISCENCE突变体的表现型(Sanders et al.，2000)

Stage12:代表花药发育的第12个时期(见图5-2中的描述); Stage13:代表花药第13个时期;

Stage13L:代表花药发育的第13个时期的晚期;

Stage14:代表花药发育的第14个时期。A:花药;

F:花丝; Ov:子房; Pa:柱头突起; Sg:柱头;

Sy:花柱。

3.花粉发育过程中重要调控基因的突变体表型

(1) DELAYED-DEHISCENCE:控制花药裂开和花粉释放，基因突变后表现为花药裂开和花粉释放延迟，妨碍了成功授粉。图5-3A为野生型拟南芥，图5-3 B为突变体。

(2) SPL8:该基因突变后的突变体降低了拟南芥的可育性。突变体小孢子囊(msp)发育不正常，并影响花丝的伸长。图5-4 A为突变体，图5-4 B为野生型拟南芥。

图5-4　spl8突变体的表现型(Unte et al.，2003)

(3) GAPT1: GAPT1对于绒粘层分化是必需的。野生型中绒毡层收缩，为小孢子发育提供了空间;突变体中绒毡层细胞继续膨大，细胞进入到小孢子之间的空间，挤压发育的小孢子，导致小孢子收缩。

【思考题】

简述花药发育的形态和细胞特征。

A、B和C为野生型，E、F和G为突变体。

图5-5　GAPT1突变体的表现型(Zheng et al.，2003)