烟草胚胎分离技术及胚胎发育过程的观察

实验四十二　烟草胚胎分离技术及胚胎发育过程的观察

【实验目的】

1.掌握烟草胚胎发育的一般过程。

1-C: 1细胞期; 2-C: 2细胞期; 4-C: 4细胞期;

8-C: 8细胞期; G:球形胚时期; E-H:心形胚早期; B-C:子叶期早期;

M-C:成熟子叶期; WT:野生型

图5-9　rsh突变体的表现型分析(Hall et al.，2002)

2.熟练掌握烟草胚胎的分离技术。

【实验原理】

烟草的胚胎发育过程与拟南芥相似，均经历了受精形成合子、原胚、球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶期。合子形成后，一般会经过一段时间的休眠期。在休眠期间，合子发生一系列变化。比如定向生长、细胞核位移和细胞器重新分布等。烟草的合子休眠期较长，约为3天。在休眠期极性建成后，合子进入一次不等分裂，分裂面垂直于顶-基轴向，形成一个较小的顶细胞和一个较大的基细胞(2细胞期)。原胚发育指从二细胞原胚开始直至分化以前的一个较长阶段。基细胞多次横向分裂形成一列细胞即胚柄，顶细胞分裂形成胚体。从时间上看，基细胞的分裂一般在顶细胞之前，随后顶细胞不断分裂形成四分体、八分体。16胞原胚形成后，原表皮的细胞进行垂周分裂，而内部的8个细胞进行纵向分裂直至形成球形胚。此时由于内部细胞的继续分裂，球形胚体积不断增大，原表皮细胞进行垂周分裂以保持与内部逐渐扩大的协调，随后在即将形成子叶的位置上细胞分裂频率增加，开始出现子叶原基，随后胚变成了心形胚。随后子叶和下胚轴的细胞继续分裂使得器官生长，下胚轴在生长过程中相对垂直，但是子叶部分的细胞由于不同程度的扩展而变为弯曲的，逐渐形成成熟胚。

胚胎培养是植物细胞工程的主要手段，也是研究植物胚胎发育的重要方法之一。胚胎培养的研究已经有近一个世纪的历史。随着培养技术的不断优化，胚胎培养技术已经经历了由成熟胚培养—幼胚培养—合子培养这样一个渐进的过程。将胚胎从胚珠中分离出来，在体外进行培养，这一技术使得研究胚胎发生以及通过改变环境条件、营养和激素等来研究胚胎的发育成为可能。

烟草胚珠较小且珠心组织较厚，单纯的机械解剖方法很难分离出胚胎。研究者通过比较酶解震荡法、酶解解剖法和酶解-研磨法在分离烟草合子方面的优劣，提出酶解-研磨法所需时间短、分离效率高，并且该种方法可操作性和可重复性均较好，是一种实用的方法(何玉池，2004)。

【实验材料】

烟草(Nicotiana tabacum L.)品种SR-1。材料种植于温室，在25℃，16小时光照条件下以常规方法种植与管理。

【药品试剂】

甘露醇，纤维素酶，离析酶，无水乙醇。

【实验方法】

一、合子和2-细胞原胚的分离技术——酶解法-研磨法

1.取授粉后约96小时的子房(分离合子)和授粉后约108小时的子房(分离2-细胞原胚)。

2.采用酶解-研磨法分离受精后生活胚囊。酶液配方为: 13%甘露醇，1%纤维素酶，0.8%离析酶。

3.收集分离的胚囊并将其继续短时间酶解，酶处理时间为10分钟，酶液为: 13%甘露醇(pH5.6)，0.25%纤维素酶和0.2%离析酶。

4.用自制的解剖针小心分离出合子和2-细胞原胚。

二、刚受精胚囊的分离技术——酶解法

1.取刚受精的胚珠固定，用卡诺固定液(无水乙醇∶冰醋酸∶3∶1)固定1～2小时，用75%乙醇，50%乙醇，25%乙醇和水进行复水，每级20分钟，以保持胚囊原有形状。

2.将胚珠放入酶液中(1%纤维素酶和0.8%离析酶溶于13%甘露醇，pH5.8)，25℃酶解3小时。

3.洗去酶液，用微量移液器吹吸胚珠，使胚囊释放出来，用微吸管吸取胚囊用于观察和进一步实验。

【思考题】

1.简述酶解-研磨法分离烟草合子的原理。

2.利用酶解-研磨法分离烟草合子的注意事项有哪些?