任务3 培养细胞的常规检查和生物学检测
细胞接种或传代后，要定时对细胞做常规检查，以便于发现异常情况，及时对症处理。根据细胞种类和实验要求，细胞的常规检查包括培养液观察、生长状态判断、微生物和化学污染检查等。而培养细胞生长成为形态上单一的细胞群或细胞系（株）后，无论是使用它们进行研究工作，还是做建系（株）工作，都需要全面了解这些细胞的生物学特性，以便进一步开展相关实验。培养细胞的生物学检测项目一般包括细胞形态描述、细胞免疫定性、细胞生长曲线、细胞分裂指数（MI）、细胞标记指数、细胞DNA定量、细胞周期等。
一、培养细胞的常规检查
细胞接种或传代后，根据细胞种类和实验要求，实验人员要定时对细胞做常规检查，如观察培养液的颜色变化、测定pH值、判断细胞生长状态和从清亮度判断是否污染等，以便随时掌握细胞动态变化，一旦发现异常情况可以及时对症处理。
（一）营养液颜色观察和pH值检测
新鲜RPMI-1640培养液在pH 7.2左右应是橙红色，适合多数细胞生长。细胞生长旺盛时代谢产生的酸性物质积累增多，营养液因酸化而逐渐变黄，pH值下降；若培养瓶瓶塞刷洗不干净，残留有碱性物质，致使营养液pH值升高，颜色会变为紫红色。上述两种情况对培养细胞的生长都将不利，严重时导致细胞脱落死亡。适时更换培养液可以维持培养细胞的条件。
更换培养液的时间可依营养物的消耗而确定。原代细胞经24h培养，培养液颜色变浅，表示细胞代谢好。少量换液能刺激细胞生长，通常是每周换液两次，每次换半量或1／3量。原代细胞第一次换液时，切记不要把原培养液倒掉。因为原培养液中有体内带来的细胞因子，有利于原代细胞存活。这对高分化的胰腺细胞、肝脏细胞、内皮细胞等尤为重要。若培养液颜色变深或没有变化，这是细胞生长代谢不好的信号。再观察数日，如液体颜色加深发紫，则表示细胞已经死亡。细胞系（株）细胞在条件合适时生长迅速，若细胞接种数大，培养液过夜变黄。此类细胞换液时，可以将液体全部换掉。最好的方法是减小细胞接种数，延长换液时间，进行半量换液。
（二）细胞生长状态判断
1.细胞的生长状态
原代细胞悬液接种以后，都有不同的潜伏期。胚胎组织、幼体组织潜伏期短，一般在第二天即可见细胞生长，一周内连接成片。成年组织的潜伏期长，老年组织和癌组织的更长（1～4周）。肺组织块培养时，从小组织块中最早移出来的是游走细胞，它们单独活动，形态不规则。在游走细胞后接着移出的是内皮细胞、成纤维细胞和上皮细胞等。细胞分裂开始后，细胞数量逐渐增多，当形成较大的生长晕或连接成片时，才真正进入生长状态。成纤维细胞是最易生长的细胞，生长速度快，前哨部位成纤维细胞呈放射火焰状或螺旋状向外扩展。最边缘的细胞能够单独活动，借助变形运动向前延伸，细胞密度增大时才连接成片，细胞密度不大时，则连接成网状。上皮细胞排列紧密，相互连接呈膜状，边缘整齐，细胞很少单独活动，生长时整个上皮膜一起移动。上皮细胞尤其是外胚层来源的细胞，如表皮细胞，在生长过程中产生透明质酸酶，能使细胞间质发生液化，导致细胞相互分离卷曲，形成所谓的拉网现象，严重时可使细胞脱落。
2.健康细胞和衰老细胞
光学显微镜下生长状态良好的细胞均质、明亮、透明度大、折光性强，在相差显微镜下可以看清细胞的形态结构，细胞质中有粗大的线粒体颗粒和核。在细胞衰老、机能不良时，细胞质中常出现黑色颗粒、空泡或脂滴（图1-47），细胞间空隙加大，细胞形态变得不规则或失去原有特性。只有状态良好的健康细胞才宜进行实验。在很多情况下，细胞虽机能状态不良，但仍可生长，如支原体轻度污染时即如此。因此，细胞生长与否不能作为判断细胞好坏的唯一标准，必须做全面分析。
图1-47 衰老细胞
（a）大鼠衰老胰腺细胞；（b）衰老成纤维细胞
（三）微生物污染检查
在长时间的细胞培养工作中，即使实验用品消毒彻底、无菌操作严格，也难免偶尔发生各种污染。污染主要来源于培养用液（培养液、血清、胰蛋白酶等），或操作时由空气播散所致。常见的有细菌污染、真菌污染、支原体污染、原生动物污染等。
1.细菌污染
细菌污染时，常引起培养液混浊，污染的培养液在显微镜下可见大量细菌，常见的有白色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等。有时虽培养液清亮，但细胞生长缓慢，可用肉汤或琼脂培养基在37℃培养数日，观察肉汤培养基是否混浊，或琼脂培养基有无菌落形成，以验证是否被污染。葡萄球菌污染如图1-48所示。
图1-48 葡萄球菌污染
2.真菌污染
真菌污染时，有的肉眼可见，呈白色、灰蓝色或浅黄色的菌落小点漂浮于培养液表面；有的散在生长，镜下可见丝状、瘤状或树枝状菌丝（菌丝末端有孢子），纵横交错，穿行于细胞之间。酵母菌和念珠菌常污染细胞，它们没有丝状结构，呈卵圆形，常散在细胞周边和细胞之间生长（酵母菌成堆生长，念珠菌呈链状生长），如图1-49和图1-50所示。酵母菌污染时，培养液混浊。念珠菌污染的液体清亮。
图1-49 酵母菌污染
图1-50 念珠菌污染
3.支原体污染
细胞培养物被支原体污染甚为普遍，多数实验证实，支原体污染（图1-51）的主要来源为操作者和血清。因此，在细胞培养操作过程中，应防范人支原体对细胞的污染。支原体无细胞壁，呈高度多形性，最小直径大约0.2μm，可通过滤菌器，相差显微镜下支原体呈暗色细小颗粒，有类似布朗运动，位于细胞表面和细胞之间。被支原体污染后的培养液不混浊，多数细胞无明显变化或有细微变化，可因传代和换液而被缓解，所以在观察不够细致或缺乏经验时，往往给人以“正常”的感觉。在个别严重情况下，细胞增殖缓慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。实验证实，支原体能抑制骨髓瘤细胞生长，降低融合率；有DNA活性的支原体能降低DNA合成；需尿嘧啶型的支原体能影响RNA的合成；需精氨酸型的支原体则可快速消耗培养液中的精氨酸，影响细胞DNA的合成。各类细胞对支原体的感受性和反应性也有差异，从原代细胞培养物一般不污染支原体的现象可以说明，原代细胞和二倍体细胞对支原体的耐受性强，多倍体细胞和无限细胞系对支原体敏感，表明支原体对转化的细胞和肿瘤细胞似乎具有亲和力。
图1-51 支原体污染
注：扫描电镜显示支原体，附于细胞表面众多的圆形颗粒为支原体。
4.病毒污染
细胞培养物中有内源性和外源性病毒污染。它们威胁着细胞系（株）的质量，也危及操作人员的身体健康。因为病毒的高危性，对于此类污染物，实验者一定要在二级生物安全区内规范操作。
（四）细胞交叉污染检查
细胞交叉污染是在细胞培养操作过程中，多种细胞培养同时进行时，器材和培养用液混杂所致的污染。这种污染使得细胞形态和生物学特性发生变化，但某些变化不易察觉。有些污染细胞（如HeLa细胞等）具有生长优势，最终压过其他细胞，使其他细胞生长受到抑制，最终死亡。细胞交叉污染导致细胞种类不纯，不能进行实验研究。
细胞交叉污染的防止措施如下：
（1）实验器材不能混用，几种细胞同时培养时，器材要做好专用标记；
（2）细胞培养用液公用时，细胞吸管和细胞用液吸管要分开，千万不能用细胞吸管直接吸细胞培养液。
（五）化学物质污染检查
化学污染物质是一些对细胞有毒性的或对细胞产生刺激的化学物质，主要包括残存洗涤剂、细胞内毒素等。细胞直接接触物（如培养皿、生长基质、培养基等）或间接接触物（如配制培养基的器皿、瓶塞、瓶盖等）一旦被化学物质污染，将导致细胞死亡。化学物质污染是细胞培养失败的重要原因，因此细胞实验所使用的全部实验器材都要严格清洗，并应正确掌握器材操作要领。
二、培养细胞的生物学检测
培养的细胞生长成为形态上单一的细胞群或细胞系（株）后，无论是使用它们进行研究工作，还是做建系（株）工作，都需要全面了解这些细胞的生物学特性。检查项目一般有细胞形态学检测、细胞活力检测、细胞生长曲线测定、细胞分裂指数（MI）测定、细胞标记指数测定、细胞DNA定量测定、细胞周期测定等。
（一）细胞形态学检测
用相差显微镜观察活细胞并摄影，主要可以观察到细胞形态、大小、核浆比例、染色质多少和核仁大小等。采用盖玻片培养技术和Giemsa（吉姆萨）染色法能简便、快速地获得细胞光镜图像特征，如果再与电镜技术结合，可观察到细胞的活性形态，获得细胞亚显微结构图像。
在电镜下观察活细胞，需要进行固定。细胞固定的目的在于迅速终止组织内各种酶的活性，防止细胞自溶，保持组织细胞完整的形态结构，使细胞内化学物质和酶能准确定位。
1.细胞培养物固定前的处理
各种细胞培养材料如盖玻片培养物、单层培养物、悬浮培养物等，都可进行细胞固定。盖玻片取出后经Hank′s液漂洗多次，洗去血清和附着在细胞表面的死细胞残渣。悬浮培养细胞经低速离心去除血清，再用Hank′s液清洗后制成涂片，空气干燥。
2.常用固定液
甲醇、酒精、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等是常用的细胞固定剂，但不同固定剂所固定的细胞化学成分、酶类及细胞结构的细腻度均不相同，如显示多糖常用酒精固定，而显示酶类多用甲醛缓冲液或丙酮固定。
（1）4%甲醛磷酸盐缓冲液。配制方法：取10mL 40%中性福尔马林、0.78g无水Na2HPO4、0.42g无水NaH2PO4、0.85g NaCl，加水至100mL。
4%甲醛磷酸盐缓冲液能保存多种蛋白质或酶类，其渗透力强，组织细胞收缩较少。经固定的组织细胞核染色好，但细胞浆着色差。
甲醛为无色气体，溶于水成为甲醛水溶液，含37%～40%甲醛的水溶液称为福尔马林。福尔马林久存会产生白色的三聚甲醛，经氧化变成甲酸使溶液呈酸性，酸性福尔马林可使固定的组织呈酸性，影响细胞核的嗜碱性染色。因此，可在甲醛溶液中投入适量的碳酸镁、碳酸钙或粉笔以中和其酸性。取得标本后，勿让其干燥，切成小块（约2cm×2cm×0.4cm），加适量固定液，固定6～12h，流水冲洗过夜，酒精中行梯度脱水，起始浓度为30%。固定时间较长的组织，则需经24～48h流水冲洗，以防止标本因甲酸的沉淀而影响染色效果。
（2）Bouin氏固定液。配制方法：先将75mL饱和苦味酸（100mL水中加1.2～1.4 g苦味酸）过滤，加入40%甲醛（有沉淀者禁用），最后加入5mL冰醋酸，混合后存于4℃冰箱中备用。冰醋酸最好在临用前加入。
Bouin氏固定液用于固定双盖玻片培养的标本，固定30min后，用70%酒精褪去苦味酸的黄色，如不立即染色，可将标本保存在70%酒精中。本试剂适用于组织细胞的糖原固定。
（3）FAA固定液（10mL 80%酒精、5mL冰醋酸、5mL中性福尔马林）。用于盖玻片细胞培养物的固定，主要固定核蛋白。将细胞盖玻片置于4℃FAA固定液的气相中，固定24h，细胞形态极佳。
（4）Carnoy固定液（60mL纯酒精、30mL氯仿、10mL冰醋酸）。临用前配制，是较好的非水溶性固定液，其穿透力强而快，适用于核蛋白、黏多糖和催乳素等物质的固定。
（5）甲醇-冰醋酸固定液（3∶1，此液使用前混合）。适用于细胞及组织小块的固定，能较好地固定核蛋白，固定后进行Giemsa染色，效果极佳。
（6）4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液。在50mL蒸馏水中加入多聚甲醛4g，加热至60～70℃时，边搅拌边逐滴加入2mol／L NaOH溶液，至液体澄清透明。用1mol／L HCl溶液调节pH值至7.4，冷却后加入0.01mol／L PBS至100mL，4℃下保存。本试剂适用于肾纤维蛋白的固定。
（7）丙酮。丙酮普遍用做酶的固定剂，一般细胞于4℃用纯丙酮固定5～10min，组织块需固定1～2h。
3.Giemsa染色法
培养于盖玻片上的细胞，常采用Giemsa染色法染色。
（1）试剂。
①甲醇-冰醋酸固定液。将3份甲醇和1份冰醋酸混合，临用时配制。
②pH 7.0磷酸盐缓冲液。将62mL 1／15mol／L Na2HPO4溶液和38mL 1／15mol／L NaH2PO4溶液混合。
③染液。
Giemsa储存液：取0.5g Giemsa，先用少量甘油研磨，加甘油至定量（33mL）后，放在56℃水浴中90min，再加入33mL甲醇，热过滤，棕色瓶中保存。
Giemsa应用液：1mL pH 7.0磷酸盐缓冲液加Giemsa储存液1滴（用滴管加）。
（2）染色。
①根据缺角标记端辨认盖玻片细胞生长面，用Hank′s液轻轻漂洗盖玻片4遍（注意盖玻片两面都要漂洗），以去除血清。
②标本未完全干燥时，将其置于青霉素瓶口上，用甲醇-冰醋酸固定液固定5min，中间换固定液一次。
③固定后，空气干燥，将盖玻片置于另一个青霉素瓶口上。
④加Giemsa应用液染色15min。
⑤流水冲洗3min，空气干燥，用中性树胶封片、镜检和标记、摄影。
4.注意事项
（1）细胞湿片一般采用空气干燥法干燥，也可在火焰上方扇动干燥。
（2）固定后，盖玻片一定要干燥后染色（注意夹镊部位的干燥），否则残留固定液会使局部浅染、不染或染成褐色。
（3）染色后，不能先倒去染料后冲洗，因为染液表面常形成一层氧化膜，若先倒去液体，这层氧化膜易附在片上形成污渣，不易被水冲掉，结果细胞和背景都不清晰。另外，染液加得过多，液体容易流走，或因实验时空气干燥，液体挥发过快，都会使得氧化膜附在标本上。正确方法是，让少量流水从盖玻片一端流下，染料随流水冲走。
（4）冲洗后的染色标本一定要干燥后封片，否则用中性树胶封片后，残留的水与中性树胶作用，标本局部出现乳白色混浊。
5.培养细胞的观察
（1）细胞培养物的观察。观察培养液颜色、清亮度。相差显微镜下观察细胞类型、细胞结构和有无微生物污染，判断细胞生长状态。
（2）细胞制片的观察。光学显微镜下观察细胞形态、结构及类别，有无细菌、真菌污染。
（二）细胞活力检测
非整倍体无限细胞系和癌细胞株中存在不同细胞亚群，它们的功能和生长特点各异，其中有些亚群细胞对培养环境有较大的适应性，具有较强的独立生存能力，细胞克隆率高，所以用细胞克隆方法可纯化某一亚群细胞，检查细胞活力。细胞克隆化培养之前，应先测定细胞克隆形成率，以了解细胞在极低密度条件下的生长能力。
1.细胞克隆形成率实验
单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体称为克隆。每个克隆含50个以上的细胞，大小在0.3～1.0mm。克隆形成率用来表示细胞独立生存的能力，其常用实验方法有平板克隆形成实验、软琼脂克隆形成实验及平板琼脂克隆培养法。下面主要介绍平板克隆形成实验。本法适用于贴壁生长的细胞培养的正常细胞和肿瘤细胞。
其操作方法如下。
（1）反复吹打细胞悬液，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95%以上。
（2）按照细胞密度梯度，如50个、100个、200个，分别接种于10mL预温的培养皿（直径9cm）中，十字形轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。
（3）将培养皿置于37℃、5%CO2培养箱中培养2～3周，此期间根据培养液pH值的变化，适时更换新鲜培养液。
（4）当培养皿中出现肉眼可见的细胞克隆时，终止培养，弃去培养液，用平衡盐溶液小心浸洗2次，空气干燥；用甲醇固定15min，弃甲醇后空气干燥；用Giemsa应用液染色15min，用流水缓慢洗去染液，空气干燥；显微镜下计数大于50个细胞的克隆数，然后按下式计算克隆形成率：
克隆形成率＝克隆数／接种细胞数×100%
2.四唑盐比色法
四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝，化学名为3-（4，5）-二甲基-2-噻唑-（2，5）-二苯基溴化四氮唑。四唑盐比色法的原理是，活细胞中的脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝色产物——甲臜（formazan），并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。用二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中的蓝紫色结晶物，溶液颜色的深浅与所含的甲臜量成正比，再用酶标仪或微孔板比色仪测定吸光度值。四唑盐比色法简单、快速、准确，广泛用于新药筛选、细胞毒性实验、肿瘤放射敏感性实验。它与软琼脂克隆形成实验、3 H-TdR渗入法、细胞计数法等相关性好，近年来一些实验室用四唑盐比色法测定细胞生长曲线。
（三）细胞生长曲线测定
对于对数生长期细胞，采用常规消化传代方法制成细胞悬液。一般接种7～8组，每组3瓶（也可用24孔培养板）。每天检查一组，每瓶计数4次，取其平均值，再计算3瓶的平均值，连续计数7～10d。最后用坐标纸绘出逐日细胞数，即得细胞生长曲线，如图1-52所示。细胞数量增加一倍的时间即细胞倍增时间。
图1-52 细胞生长曲线
绘制细胞生长曲线的注意事项如下。
（1）根据细胞生长特点，选择合适的接种密度。
（2）培养瓶规格、各瓶培养液量、接种细胞数都要相同。
（3）不同细胞生长速度相比较时，细胞接种密度要相同。三天后未计数的细胞要换液并保持原培养液量。
（4）此法常用，但较烦琐并有误差。目前一些实验室也采用四唑盐比色法绘制细胞生长曲线，且更快速准确。
（四）细胞分裂指数（MI）测定
细胞分裂指数（MI）是指1000个细胞中细胞分裂相的数目，用以表示细胞增殖的旺盛程度。计算MI时要将细胞悬液接种在有盖玻片的培养皿（孔）中，逐日取出盖玻片（取前3h加入终浓度为0.02μg／mL的秋水仙素），经固定、Giemsa染色、封片制成标本。镜下观察分裂相并计数，观察时要选择密度近似区，以减少误差。取得逐日分裂相数值后，即可绘成细胞分裂指数曲线。
（五）细胞标记指数测定
用3 H-TdR作为DNA合成前体标记，将其渗入细胞群中。凡被渗入的细胞即被标记，结合放射自显影技术，计数1000个细胞中被标记的细胞数，可以了解细胞DNA合成情况。
（六）细胞DNA定量测定
细胞培养技术结合Fulgen染色法和显微分光光度技术，或细胞DNA荧光染色结合流式细胞仪测试分析，可检测细胞DNA的含量，确定测试细胞的倍体类型。
（七）细胞周期测定
细胞周期由细胞间期（G1期、S期、G2期）和细胞分裂期（M期）组成。细胞群体倍增时间的概念与细胞周期的不同，在细胞群体倍增时间内有些细胞不分裂，有些细胞可分裂数次，一般细胞周期短于细胞群体倍增时间。
细胞周期的测定方法有以下几种。
1.同位素标记测定法
将细胞接种在有盖玻片的培养皿（孔）中，在细胞进入对数生长期时用3 H-TdR标记细胞30min，以后每隔30min取样一次，直到48h为止，然后用放射自显影或液闪计数法来观察和计算细胞分裂相出现、高峰、消失的时间，并记录各时间分裂相数目，绘制成图进行分析。这项技术在测定细胞周期的同时，也可了解细胞DNA合成情况。
2.流式细胞仪测定法
将对数生长期细胞制成106个／mL单细胞悬液，然后根据流式细胞仪的检测步骤进行操作，最后用计算机分析结果并计算出细胞周期。
流式细胞仪是对细胞或细胞器的结构（如大分子核酸、酶、抗原和碱基、外源凝集素等化学物质）和细胞某些功能（如膜电位和膜流动性、酶蛋白活性、DNA合成、细胞内pH值和氧化还原状态等）进行定量测定的仪器，并可根据细胞亚群特定性质对细胞进行分类。流式细胞仪检测的对象是单个细胞和单个细胞核悬液。使用PBS或基础营养液稀释细胞，保持细胞活性和功能。细胞悬液中不能有团块或过多的细胞碎片，以免堵塞仪器喷嘴。细胞密度要求是106个／mL，细胞过多会堵塞喷嘴，过少则使测量时间延长。
流式细胞仪测量的细胞参量有两类：一类是内部参量，细胞不用荧光素标记，如测量细胞大小和形状、细胞颗粒和色素，了解细胞氧化还原状态；另一类是外部参量，细胞需荧光素标记，如测量细胞核酸、碱基、蛋白质、糖类、Ca2＋等，了解细胞结构和功能。细胞在荧光素标记前，需先进行固定处理。
细胞固定方法：将各种来源的细胞样品（如对数生长期单细胞悬液，或组织消化分离的细胞或细胞核悬液）300r／min离心5min，沉淀加0.5mL PBS混匀，用细滴管或注射器将细胞悬液迅速喷射到4℃75%酒精中，或将75%冷酒精倒入细胞悬液中，边倒边混匀。再经75%冷酒精洗涤后，4℃冰箱中固定18h以上。上机测试前，将4℃细胞悬液用PBS洗涤两次，取0.5mL细胞悬液（106个／mL）进行荧光素标记和流式细胞仪分析。
知识拓展
荧光定量细胞分析系统
基于荧光定量的细胞成像分析（如细胞表面抗原分析、核酸含量细胞周期分析、细胞凋亡分析、荧光蛋白表达定量等）是近年来生物实验室中的最主流的分析技术之一。然而相关的设备（如流式细胞仪等）需要有丰富经验者才能操作自如，且消耗许多昂贵的抗体和试剂，需要很高的清洗、维护成本。
丹麦Chemo Metec A／S公司开发了一系列产品，特别是Nucleo Counter NC3000（图1-53），可提供全方位的分析系统，解决上述诸多问题。其特点如下。
图1-53 荧光定量细胞分析系统
（1）具有8个光源、9个荧光通道，覆盖红外到紫外的全光谱分析系统；
（2）具有智能模块式应用和自定义应用的全方位分析系统，满足多层次客户的需求；
（3）全自动化，一键式按钮分析；
（4）无须设置参数，减少人为主观影响；
（5）无须清洗、维护、校正；
（6）所需样品体积小，只需9μL。
思考题
1.细胞交叉污染的防止措施有哪些？
2.简述四唑盐比色法。
3.试述绘制细胞生长曲线的注意事项。
4.如何得到细胞的生长曲线？
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