细胞培养法用于病毒的分离和培养

细胞培养法用于病毒的分离和培养_动物细胞培养技术

任务2　细胞培养法用于病毒的分离和培养

一、细胞培养用于病毒研究的优点

细胞培养用于病毒研究具有以下优点。

1.没有隐性感染

动物可能带有某些病毒的隐性感染，往往有干扰作用和假阳性出现。但对于细胞培养，一方面细胞来源于动物部分组织，减少了隐性感染的机会，另一方面组织培养细胞可进行预先检查而加以克服。

2.没有免疫力

动物经隐性感染获得免疫力，对接种病毒会发生抵抗，但由于后天免疫一般不表现为细胞抵抗力的增加，因此体外细胞无免疫力，利于病毒生长。

3.容易选择易感细胞

细胞来源方便，可供病毒敏感性的筛选，可以从中选择最敏感的细胞以满足实验要求，同时还有利于从单一细胞水平上研究病毒的繁殖过程和病毒与细胞的相互关系。

4.接种量大

动物和鸡胚的接种均受数量、年龄、途径的限制，而细胞不仅可以大量生产，而且可以较久地持续培养，便于病毒生长，特别是对那些生长缓慢或需在新环境中逐渐适应的病毒更为有利。

5.培养条件易于控制

由于细胞培养可以人为控制温度、气体、pH值、培养基成分，因此可采用大规模生产方式来生产细胞和病毒及细胞产物。

6.可提高疫苗的产量和质量

细胞的大量生产可满足疫苗产量的需求，而且异性蛋白少，引起变态反应的机会少。疫苗中污染菌少或无，可随制随用，成本低，来源方便，便于储存，且效力均匀，易标准化。

7.加速病毒分离过程

采用细胞培养分离病毒不仅阳性率高，而且可显著加速分离过程，早出结果，但应选用对该病毒敏感的细胞。

二、病毒的细胞培养技术

（一）制备病毒悬液

1.接种标本的处理

（1）接种病料的处理。

将病料剪碎、充分研磨，加生理盐水制备成1∶10匀浆，反复冻熔3次，3000r／min离心，取上清液，过滤除菌，每毫升加青霉素1000U和链霉素1000μg，室温放置1～2min。

（2）粪便标本。

将用于分离肠道病毒的粪便标本放入装玻璃珠的40mL沉淀管内，大约每2g粪便用15mL　Hank′s液稀释（其余粪便于-20℃保存，备用），用橡皮塞塞紧后剧烈振摇，使粪便乳化，经2500r／min离心沉淀15min后，将上清液用无菌八层纱布过滤，于4℃以10000r／min离心沉淀1h，再取其上清液1.8mL，加入0.2mL抗菌素液进行处理（浓度为25000U／mL的双抗及250mg／L二性霉素B），剩下的悬液保存于-20℃备用。用在4℃下经抗菌素处理1h后的悬液接种两管猴肾细胞和人二倍体细胞，每管0.25mL，37℃下培养，观察CPE。如果接种材料毒性大，出现非特异性的细胞退化，则将培养物尽快传代。

（3）肛门拭子。

肛门拭子擦拭后放在约2mL的肉汤内，低温保存，培养前挤出液体于4℃下2500 r／min离心沉淀15min，抗菌素处理及接种细胞培养方法同上。

（4）咽漱液及鼻咽拭子。

呼吸道病毒常取咽漱液或鼻咽拭子（放在肉汤内）标本，立即接种细胞培养物或保存于-70℃，抗菌素处理方法同上。抗菌素处理（4℃，1h）后，即可接种两管以上的细胞培养物，每管0.2mL，37℃下培养，观察CPE（或进行血吸附实验，或观察干扰现象，依病毒种类而定）。

（5）组织悬液。

将活体检查或尸体解剖取出的组织保存于-70℃。取出此组织并选择适当的样品放入无菌培养皿内称重，然后移入乳钵内，加入含0.75%牛血清白蛋白的缓冲液，磨成20%悬液，若为结缔组织应加入适量铝氧粉研磨。此悬液经1500r／min离心沉淀15 min，吸掉上清液，取适量标本经500U／mL双抗处理，4℃下1h，以每管0.1～0.2mL接种2～4管细胞，37℃下培养，观察CPE，或进行血吸附实验，或观察干扰现象，必要时也可接种于动物。原标本及剩余组织悬液均保存于-70℃。

2.病毒接种前的预处理

有些病毒很难适应细胞培养生长，需在接种前经胰蛋白酶等蛋白水解酶处理后才能适应细胞，且维持液中不加血清。如轮状病毒接种前要先与等量的30μg／mL的胰蛋白酶混合，37℃作用1h后才能接种细胞，其原因在于轮状病毒表面VP4能抑制病毒在细胞上的生长，但VP4对胰蛋白酶敏感，用胰蛋白酶处理病毒后将VP4裂解为VP5和VP8，暴露出和细胞受体相结合的位点，增强病毒的生长繁殖能力。

（二）病毒的细胞培养条件的选择

用于培养病毒的细胞，特别是细胞株，必须严格鉴定，并多设置不接种病毒或可疑材料的空白对照。因为组织培养细胞，特别是原代细胞或由原代细胞传代育成的细胞株，往往自身携带病毒，常被误以为是预分离的病毒，从而产生错误的结论。

病毒的细胞培养通常用人胚肾（或猴肾）细胞、WISH及FL人胚羊膜细胞、人胚二倍体细胞（WI38、2BS、SL8等）、鸡胚细胞及传代细胞（如HeLa细胞、Hep-2细胞和KB细胞）等制备的单层细胞。分离培养病毒常用的细胞见表2-1。

表2-1　分离培养病毒常用的细胞

1.培养细胞的选择

分离培养病毒时应选择易感细胞。一般情况下，同源性细胞为病毒的易感细胞。例如，禽类的病毒一般可选择鸡胚成纤维细胞；FPV可选择FK18细胞；CDV可用Vero细胞或MDCK细胞；CAV可选用MDCK细胞。乙型脑炎病毒易在仓鼠肾、猪肾、羊胚肾和鸡胚等原代细胞上增殖，并常呈现明显的细胞病变或出现蚀斑；伪狂犬病病毒可在鸡胚、小白鼠、仓鼠、猪、兔、狗等许多动物和人的许多组织的原代细胞和传（继）代细胞中生长，但在WI38、小鼠成神经细胞瘤细胞中产生的病毒效价最高，并形成明显的细胞病变；马传染性贫血（马传贫）病毒只能在马属动物的原代白细胞和骨髓细胞以及某些传代细胞内增殖等。关于哪些类型的细胞对哪些种类的病毒具有敏感性，没有明确的规律可循，只能依靠经验，也就是通过实践来发现和验证。因此在分离未知病毒时，应多选几种细胞同时进行分离培养，以便增加分离成功的机会。病毒须在敏感的宿主细胞中增殖，病毒培养的宿主细胞一般选择相应易感动物等。但非敏感动物的细胞有时也能使病毒生长，如鸭胚成纤维细胞可培养马立克氏病病毒。通常病毒的细胞感染谱是通过试验获得的，同一病毒在不同敏感细胞增殖后毒价不尽相同。常见病毒的细胞感染谱见表2-2。

表22常见病毒的细胞感染谱

续表

2.病毒的细胞培养方式的选择

对于分离特别困难的病毒，可以考虑使用带毒培养方法。若某系病毒的分离培养特别困难，器官培养可能是比较有效的一个方法。例如，一些新的呼吸道和肠道病毒就是通过这个途径获得的。带毒培养方法适用于污染严重或含有的活病毒量较少的病料。具体方法是，先用病料悬液接种健康同种动物或易感实验动物，当其出现可疑症状时扑杀，立即无菌采取可能感染病毒的组织器官进行原代细胞培养，经48～72h，细胞基本长成单层时换维持液，以后每天镜检CPE一次。这种带毒培养的细胞，往往在原代即可产生CPE。为提高病毒分离率，当原代培养没有出现明显CPE时，可将原代细胞盲目地进行次代培养，有时原代细胞未出现CPE或CPE不明显，而于次代培养时出现。另外，这种方法也可用于已知CPE不明显的病毒的培养传代，方法是将此带毒培养物用胰蛋白酶消化后作1∶1或1∶2传代培养，往往在带毒传代以后，病毒对细胞的毒力表现增强，CPE恢复正常。

3.细胞培养物接种病毒的时机的选择

多数病毒是在培养细胞长成或基本长成单层后，在换液的同时接种病毒，但细小病毒例外，要在接种细胞的同时接种病毒。原因在于这类病毒复制过程中编码能力有缺陷，需要依赖细胞有丝分裂过程中的某些功能才能完成病毒粒的复制，因此需要与细胞传代同步接毒。

4.病毒培养的条件

病毒在敏感细胞上增殖需要一定的条件，包括维持液、犊牛血清量、温度、pH值、病毒接种量和方法等。只有在最佳条件下，病毒才能大量增殖，毒价才会最高。

（1）血清。细胞培养必须加一定量的血清。但是，血清中存在一些非特异性抑制因子，对某些病毒的生长和增殖有抑制作用。为了克服血清中非特异性抑制因子的作用，病毒维持液内犊牛血清含量一般不超过2%。

（2）温度。大多数病毒培养的最适温度为35～37℃，此温度有利于病毒吸附和侵入细胞，如口蹄疫病毒于37℃可在3～5min内使90%的敏感细胞发生感染，而在25℃时需要20min，15℃以下则很少引起感染。但有些病毒的最适温度或高于37℃，或低于37℃，如鼻病毒最适温度为33℃。至于呼吸道病毒（合胞病毒除外），一般以降低温度为宜，而且以旋转鼓培养为佳，但有的病毒需静置培养，应依病毒种类而定。

（3）pH值。在配制维持液时，pH值一般在7.6～7.8才能防止细胞过早老化，有利于病毒增殖。如果维持液pH值下降过快或过低，可用7.5%NaHCO₃溶液调整。

（4）接毒量。病毒接种一般按维持液的1%～10%（体积分数）接入。接种量过小，细胞不能完全发生感染，会影响毒价；接种量过大，会产生大量无感染性缺陷病毒。为获得培养液中典型病毒和高度感染性，接种时必须用高稀释度的病毒液，如应用高浓度的病毒液传代，在第3、4代时会出现明显的缺陷病毒，发生自我干扰现象，病毒效价下降。

（三）将病毒接种于培养细胞

病毒接种细胞的方法有异步接毒和同步接毒。异步接毒是在细胞长成单层后倒去生长液，按维持液的1%～10%（体积分数）接毒，37℃吸附1h后加维持液。多数病毒采用该接毒方式。同步接毒是在接种细胞的同时或在接种细胞后4h内将病毒接入，主要用于病毒复制发生在细胞有丝分裂盛期的病毒，如细小病毒等。

1.异步接毒

异步接毒流程如图2-4所示。

图2-4　异步接毒流程

（1）将易感细胞培养，长成单层。

（2）弃去细胞培养生长液，用预热至37℃的Hank′s液（pH　7.2～7.4）洗一次，以除去细胞碎片等。

（3）加入病料上清液（或病毒悬液），接种量为生长液的1／10，以单层细胞都能接触病毒为度。在37℃放置1～2h，使病毒吸附于细胞膜。在此期间可以轻轻转动细胞培养瓶2～3次，以防部分细胞未接触到接种物。同时设细胞对照实验，即将病料上清液换成维持液接种到细胞上。

（4）弃去接种液，用pH　7.2的Hank′s液将单层细胞洗2～3次，以除去接种液内可能存在的对细胞有毒有害的物质，当接种的是粪便等病料时尤其要注意。如果接种液就是细胞培养的传代病毒，则可省略此步骤。

（5）按生长液量换加维持液，在37℃培养箱中培养。

2.同步接毒

将病毒和细胞同时接种于培养板或培养瓶中。

（四）病毒在细胞中增殖的指标

病毒在细胞中的增殖，可以根据它所引起的细胞病变、细胞代谢（颜色）反应、血凝素和特异性病毒抗原等病毒成分以及电镜直接观察而识别。

1.细胞病变效应

病毒感染细胞后，大多能引起CPE，无须染色可直接在普通光学显微镜下观察。CPE的观察应以没有接种病毒的对照瓶作为对照，仔细比较两者的区别，判断CPE属于哪种类型：细胞圆缩、肿大、坏死、溶解或脱落；细胞圆缩、堆积成葡萄串状；形成合胞体；产生包含体等。不同病毒引起的CPE不同，例如，副黏病毒、疱疹病毒和合胞病毒等引起细胞融合；腺病毒引起Hep-2细胞圆缩；呼吸道合胞病毒引起Hep-2细胞融合，形成多核巨细胞。因此，观察CPE的情况是检测病毒的常用方法。根据选择的细胞类型、CPE的种类可对标本中感染的病毒进行判定。但是应当指出，有些病毒虽然在培养细胞中增殖，但是不引起明显的CPE，如猪瘟病毒和猪圆环病毒等。细胞病变效应如图2-5、图2-6所示。

图2-5　细胞病变效应

（a）未感染病毒的HeLa细胞；（b）被B3型柯萨奇病毒感染后，细胞变圆、皱缩，细胞折光性减弱；（c）被腺病毒感染后，细胞肿胀，折光性增强，呈葡萄状排列

图2-6　病毒培养时出现的CPE

记录时“＋”代表25%以下细胞发生病变，“＋＋”代表50%左右细胞发生病变，“＋＋＋”代表75%左右细胞发生病变，“＋＋＋＋”代表近100%细胞发生病变。不同病毒CPE产生的现象不同，有的细胞变圆、坏死、破碎或脱落，如滤泡性口腔炎病毒（VSV）、B3型柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒等。有的只使细胞变圆，并堆积成葡萄状，如腺病毒。麻疹病毒、呼吸道合胞病毒可使细胞形成多核巨细胞。而有些病毒能使细胞形成包含体，位于细胞浆内或细胞核内，一至数个不等，嗜酸性或嗜碱性。

注意不同病毒感染细胞后CPE出现的时间不一致，有的在48h内出现CPE，有的在72～96h内出现CPE，有的病毒在接种后前几代可能不产生CPE，需盲传几代后才能出现明显的CPE，因此，观察CPE时要有耐心，坚持每天观察，做好记录，具体情况具体分析。

有的细胞不发生CPE，但能改变培养液的pH值，或出现红细胞吸附及血凝现象（如流感病毒或副流感病毒、NDV-F、仙台病毒），有的需用免疫荧光技术或ELISA法检测。

2.红细胞吸附

有些病毒在细胞内增殖的同时，病毒或其血凝素（hemagglutinin，HA）会出现于感染细胞膜上，使感染细胞能与红细胞结合，这种现象称为红细胞吸附现象。这是检测正黏病毒和副黏病毒的间接指标。如流感病毒在感染细胞后不出现明显的CPE，但其血凝素会出现在感染细胞上。在细胞培养中加入红细胞后，后者会吸附在被感染的细胞上。若有相应的抗血清，则能中和细胞膜上的血凝素，红细胞吸附现象不再发生，称为红细胞吸附抑制试验。

3.红细胞凝集

某些病毒感染细胞并在细胞内增殖后，从细胞内释放出来。如果这些病毒具有血凝素，用细胞培养上清液与红细胞作用，则可出现红细胞凝集现象。这也是一种检测含血凝素病毒的方法。

4.病毒干扰作用

有些病毒感染细胞后，不产生明显的CPE，但是可干扰感染同一细胞的另一种病毒的正常增殖，称为干扰作用。此法可用于检测风疹病毒。风疹病毒在感染猴肾细胞后，不产生CPE，但可抑制随后接种的埃可病毒Ⅱ型在细胞培养中的正常增殖。而埃可病毒单独感染猴肾细胞则可出现明显的CPE。

5.细胞代谢的变化

病毒感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。

（五）病毒的感染性测定

根据有无CPE来判断病毒感染性和毒力的指标是50%组织培养物感染剂量（50% tissue culture infectious dose，TCID₅₀），它是指不同稀释度的病毒液接种细胞后，使组织培养物一半发生退化的最高稀释度，也称组织培养物50%发生病变的剂量。该方法是将待测病毒作10倍系列稀释，分别接种于细胞，经过一定时间后，观察CPE等指标，以能感染50%细胞的最高稀释度为终点。

TCID₅₀的测定，首先将病毒用维持液作对数或半对数逐步稀释，每个稀释度接种于4支以上细胞培养管，接种后的培养物在适宜条件下培养，定期观察CPE，如果一半或一半以上的细胞培养出现CPE，则视为阳性（或感染），再计算TCID₅₀。

操作步骤如下。

（1）准备细胞。

取出一块细胞培养板，每个孔传8000～10000个细胞（一个T25细胞培养瓶的细胞消化后加10mL培养液正好传一块96孔板，要传匀）。每个孔的细胞铺成单层大约60%丰度即可接种病毒。

细胞对照实验选取16个孔即可。滴定与对照可以在一块培养板上进行，操作中注意不要串孔。也可以分别在不同的细胞培养板上进行，但要保证实验条件一致。

（2）稀释待测病毒液。

在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1到10^-10。

（3）接种、培养。

待细胞长成单层后，吸去96孔板中的培养液，用培养液或Hank′s液洗涤细胞一次，然后吸出培养液或Hank′s液（此步目的是去除血清，因为血清能干扰病毒的吸附）。将稀释好的病毒液加到96孔板上，每孔100μL，每个稀释度接种8个孔，若要统计分析则还要增加至16个孔。病毒稀释过程中一定要将病毒液与培养液或Hank′s液充分混匀。

37℃CO₂培养箱中培养1h，取出培养板，吸去病毒液（从低浓度向高浓度吸取，可避免串孔），加入维持液200μL，继续在37℃CO₂培养箱中培养。（切记：设置正常的细胞对照。每次实验要重复4次，计算标准差。）

（4）测定结果。

接种后按病毒增殖情况，在显微镜下观察、记录细胞病变的情况。逐日观察并记录结果，一般需要观察5～7d。如果一半或一半以上的细胞培养出现CPE，则视为阳性（或感染），再按Reed-Muench两氏法或Karber法计算TCID₅₀。

①Reed-Muench两氏法。

举例说明，接种病毒后细胞病变情况见表2-3。

表2-3　接种病毒后细胞病变情况（一）

公式如下。

lgTCID₅₀＝距离比例×稀释度对数之间的差＋高于50%病变率的稀释度的对数

＝0.8×（-1）＋（-3）

＝-3.8

TCID₅₀＝10^-3.8／（0.1mL）

含义：将该病毒稀释10^3.8倍接种100μL，可使50%的细胞发生病变。

②Karber法。

举例说明，接种病毒后细胞病变情况见表2-4。

表2-4　接种病毒后细胞病变情况（二）

公式如下。

lgTCID₅₀＝L-d（s-0.5）

式中，L为最高稀释度的对数；d为稀释度对数之间的差；s为阳性孔比率总和。

lgTCID₅₀＝-1-1×（3.375-0.5）＝-3.875

TCID₅₀＝10^-3.875（0.1mL）

含义：将该病毒稀释10^3.875倍接种100μL，可使50%的细胞发生病变。

大多数病毒的中和试验用100TCID₅₀表示，含100TCID₅₀病毒悬液的稀释方法计算如下：

TCID₅₀的对数＋2＝含100TCID₅₀病毒悬液的稀释度对数

例如：如果TCID₅₀＝10^-6.5（0.1mL），则

-6.5＋2＝-4.5，即0.1mL含100TCID₅₀病毒悬液的稀释倍数为1∶10000～1∶100000。

（六）病毒的收集和纯化

1.病毒的收集

病毒在敏感细胞内增殖，一般在CPE达80%左右时收集病毒，反复冻熔多次使病毒释放，然后3000r／min离心15～20min除去细胞碎片，上清病毒液于-20℃下保存。病毒效价测定方法多采用TCID₅₀、中和试验、琼脂扩散试验、血凝试验、ELISA和补体结合试验等免疫学方法。

2.病毒纯化的原则和方法

病毒感染的细胞培养物的培养液中不可避免地混杂有大量的细胞组织成分、培养基成分、可能污染的其他微生物与杂质。因此，细胞培养后的病毒悬液要经过纯化才能成为良好的血清学抗原，才可以用于病毒中和试验、血凝试验、补体结合试验、凝集及沉淀反应等。

（1）病毒纯度的判定依据：物理均一性；病毒效价和蛋白质含量的比例；免疫反应单一而无特异反应；结晶形成。

（2）病毒纯化的主要原则：在病毒不失活的前提下，从宿主细胞中释放出来；病毒的纯化可以应用提纯蛋白质的技术方法；在浓缩提纯病毒抗原时，应避免用可使蛋白质变性的理化方法处理，否则将改变其抗原特性，此点甚为重要。对大小、形状和密度高度一致的病毒粒，可以采取分级分离的技术。

（3）病毒的纯化方法。

不同病毒的纯化方法不一样，一般来说，先采用物理或化学方法破裂细胞，释放病毒到细胞外，再浓缩纯化。

①病毒悬液浓缩方法：a.聚乙二醇（PEG）浓缩法，这是最常用的方法，可浓缩大量病毒，对病毒抗原和结构有保护性，其中直接加入法适用于少量的病毒液，直接加入8%～10%的PEG进行浓缩，再用密度梯度离心法去除PEG，液体浓缩法适合于大量病毒，用超声波或冻熔法破裂细胞，先加NaCl至终浓度为0.5mol／L，再加PEG沉淀，固体浓缩法则是将病毒液装入透析袋，用PEG包埋；b.超滤法，即利用孔径比病毒颗粒小的硝酸纤维素膜，将水、无机盐及小分子滤过，将病毒等颗粒物质截留。

②超速离心法：a.差速离心法，不同大小和密度的粒子因起程时速度存在差异而分离，适用于从组织培养液、鸡胚尿囊液或红细胞吸附的悬液中提取病毒，先以低速和中速去除宿主细胞等杂质，再以较高速度沉淀病毒；b.密度梯度离心法，根据病毒的密度制备适宜的梯度介质，病毒铺于上面，高速离心后在介质中部形成明显的沉淀带；c.等密度梯度离心法，加CsCl于病毒液中，随离心力下降，形成连续梯度，上面密度小而下面密度大，病毒在等密度大小的位置悬浮。

3.病毒纯化的步骤

现代病毒研究往往需要大量的纯病毒粒子，以便于进行化学研究或制备抗体。下面以脊髓灰质炎病毒（polio　virus）为例，简单介绍病毒的纯化步骤。

（1）大型装置中培养细胞。

为获得足够的用于化学研究的病毒，必须制备大量病毒。每种病毒的培养都有不同的步骤。脊髓灰质炎病毒是在人或灵长类动物细胞系中培养的，可以在一大瓶沿壁生长的单层细胞上培养，也可以在轻轻搅拌的细胞悬液中培养。在有利于病毒生长的条件下，每个宿主细胞能生产10～1000个感染单位的病毒。

（2）富含病毒培养液的去除。

病毒的生长和释放伴随着细胞的破损。在病毒复制完成的时候，培养液中大多数细胞已经变成了细胞碎片。为使所有病毒分子完全释放，要通过反复冷冻—熔化的循环过程使细胞进一步破碎。然后将富含病毒的液体从培养瓶转移到离心管中，低速离心除去大分子的细胞残骸。

（3）通过沉淀将病毒物质浓缩。

由于病毒是具有蛋白质性质的，它们能通过蛋白质沉淀法沉淀。脊髓灰质炎病毒可通过高浓度的NH4Cl（每毫升培养液中加0.4g）沉淀下来。这一过程要在低温下进行，NH4Cl要在搅拌下缓慢加到培养液中。由于病毒蛋白质沉降，溶液将变得混浊，将沉淀物低速离心（2000g，1～2h），然后将含有病毒分子的沉淀物在少量磷酸盐缓冲液中再次悬浮培养。这一步骤可浓缩病毒大约10倍，99%以上的病毒粒子可沉淀回收。

（4）通过密度梯度离心最终纯化病毒。

脊髓灰质炎病毒可以通过蔗糖或CsCl的密度梯度离心纯化。在后者中，病毒在离心管中成为一个分离带，这一过程与对DNA的分离相同，须高速离心（120000g），且要进行多个小时，最好是一整夜。离心管中的液体通过试管底部一点点滴出来，分步收集不同分离带组分，要检测每一组分的病毒效价。在合适的离心条件下，所有的病毒分子都聚集在一两个组分中，所以它们是非常纯的结晶脊髓灰质炎病毒。如果能在合适的条件下浓缩大量且高纯度的病毒，就可以获得病毒晶体。这种晶体为化学分析提供了很好的材料，且易于通过X射线衍射技术进行结构分析。

下面是CsCl密度梯度离心纯化轮状病毒的方法，仅供参考。

①病毒浓缩。

a.PEG沉淀病毒：在收集到的病毒上清液中加入终浓度为5%的PEG6000，4℃搅拌过夜，10000r／min、4℃离心1.5h，弃上清液，用TNMC缓冲液（50mmol／L　Tris-HCl，pH　7.5；100mmol／L　NaCl；10mmol／L　CaCl₂；1mmol／L　MgCl₂）悬浮沉淀。

b.三氟三氯乙烷抽提：取PEG浓缩的病毒液，加入等体积的三氟三氯乙烷抽提一次，12000r／min、4℃离心10min，收集水相，用TNMC缓冲液稀释10倍后，50000 r／min、4℃离心1h，沉淀用TNMC缓冲液悬浮。

②CsCl密度梯度离心。

取病毒液，与CsCl制成56%的乳化液，装入5mL梯度离心管中，水平转头50000 r／min、4℃超速离心22h，得三条乳白色的条带。分别收集离心所得的条带，用TNMC缓冲液稀释10～15倍，50000r／min、4℃离心1.5h，去除CsCl，得到较纯的病毒。

（七）病毒的保藏

病毒的保藏在病毒研究中是一个很重要的环节，不论是病毒的基础研究，还是病毒的应用研究，都与病毒的保藏有着紧密的联系。

1.病毒保藏的原则

病毒保藏的原则如下：

（1）低温条件下保藏，温度越低越好；

（2）根据不同的病毒种类，采用不同的病毒保藏方法；

（3）在特定的保藏条件（温度、方法）下，经过一段时间保藏之后，一定要进行活化增殖，同时测定病毒活力大小，再入库保藏；

（4）在保藏过程中应尽量减少不必要的传代，传代时严格按规范操作，避免毒种交叉感染，使病毒不产生变异，保持病毒的遗传稳定性；

（5）必须开展保藏相关技术的研究，对各类病毒的最佳保藏条件进行摸索，为毒种保藏提供科学依据。

2.病毒保藏的方法

（1）冰箱保藏法。

普通冰箱保藏时，4～8℃；低温冰箱保藏时，-40～-20℃；超低温冰箱保藏时，-85℃。需加保护剂，如脱脂牛奶、血清等。此法方便，成本相对较低。此法保存时要注意停电和冰箱的故障。

（2）液氮保藏方法。

温度：-196℃。

设备：液氮发生器。

（3）冷冻真空干燥保藏法。

冷冻真空干燥保藏法又称低压冻干法、冰冻干燥法，简称冻干法。先将液态的样品冻结成固态，在真空条件下使温度下降，通过直接升华抽去水分，从而使物质脱水干燥。冻干法保藏是在低温、干燥和隔绝空气的条件下，使病毒处于休眠状态，它的代谢是相对静止的，因而使病毒可以保存较长的时间。

知识拓展

2011年9月，河南省“十一五”重大科技专项——“猪主要疫病新型诊断技术及新型疫苗研发与开发”取得重大成果，我国首创的“猪圆环病毒2型灭活疫苗”在洛阳研制成功，打破了进口疫苗垄断市场的格局，结束了我国养猪业猪圆环病毒病无国内疫苗可用的历史。自此，长期困扰我国养猪业发展的三大疫病之一——猪圆环病毒病有了克星！据悉，该疫苗主要性能指标与进口疫苗的相当，产品售价却仅为进口产品的三分之一，四年新药保护期内可为我国养猪业节约免疫成本120亿元，减少疫病损失360亿元以上，对促进农民增收、农业增效，保障我国养猪业健康发展具有重要现实意义。

思考题

1.利用细胞培养病毒时，如何进行病毒接种？

2.在进行细胞培养前，如何处理接种的病毒性材料？

3.相对于鸡胚接种和动物接种，利用动物细胞培养病毒有哪些优势？

4.什么是TCID₅₀？怎样计算TCID₅₀？