任务2 杂交瘤细胞生产单克隆抗体
一、单克隆抗体的大量制备
目前大量制备单克隆抗体的方法主要有两种：一种是动物体内生产法，这是国内外实验室所广泛采用的方法；另一种是体外培养法。
（一）动物体内生产单克隆抗体的方法
迄今为止，通常情况下均采用动物体内生产单克隆抗体的方法。鉴于绝大多数动物用杂交瘤均由BALB／c小鼠的骨髓瘤细胞与同品系的脾细胞融合而得，因此使用的动物当然首选BALB／c小鼠。
将杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔内，在小鼠腹腔内生长杂交瘤，并产生腹水，因而可得到大量的腹水单克隆抗体且抗体浓度很高。该法操作简便、经济，不过腹水中常混有小鼠的各种杂蛋白（包括Ig），因此在很多情况下要提纯后才能使用。另外，由于还有污染动物病毒的危险，故最好用SPF级小鼠。
1.材料
（1）成年BALB／c小鼠。
（2）降植烷（pristane）或液体石蜡。
（3）处于对数生长期的杂交瘤细胞。
2.方法
（1）腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3～0.5mL。
（2）7～10d后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞（5×105个／mL），每只小鼠0.2mL。
（3）间隔5d后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可用16号针头采集腹水，一般可连续采2～3次，通常每只小鼠可采5～10mL腹水。
（4）将腹水离心（2000r／min，5min），除去细胞成分和其他沉淀物，收集上清液，测定抗体效价，分装，-70℃冷冻保存备用，或冻干保存。
（二）体外培养生产单克隆抗体的方法
总体上讲，杂交瘤细胞系并不是严格的贴壁依赖性细胞，因此既可以进行单层细胞培养，又可以进行悬浮培养。杂交瘤细胞的单层细胞培养法是各个实验室最常用的手段，即将杂交瘤细胞加入培养瓶中，以含10%～15%小牛血清的培养基培养，细胞浓度以1×106～2×106个／mL为佳，然后收集培养上清液，其中单克隆抗体含量为10～50μg／mL。显然，这种方法制备的单克隆抗体量极为有限，无疑不适用于单克隆抗体的大规模生产。要想在体外大量制备单克隆抗体，就必须进行杂交瘤细胞的大量（高密度）培养。单位体积内细胞数量越多，细胞存活时间越长，单克隆抗体的浓度就越高，产量就越大。
目前在杂交瘤细胞的大量培养中，主要有两种类型的培养系统：一种是悬浮培养系统，采用转瓶或发酵罐式的生物反应器，其中包括使用微载体；另一种是细胞固定化培养系统，包括中空纤维细胞培养系统和微囊化细胞培养系统。
（三）杂交瘤细胞的无血清培养
杂交瘤细胞的体外培养绝大多数用DMEM或RPMI-1640作为基础培养基，添加10%～20%胎牛血清或新生小牛血清。基础培养基主要提供各种氨基酸、维生素、葡萄糖、无机盐、合成核酸和脂质的前体物质。血清主要供给各种营养成分，血清中的激素可刺激细胞生长，其中的许多蛋白质能结合有毒性的离子和热原质而起解毒作用，同时这些蛋白质对激素、维生素和脂类有稳定和调节作用。但是，血清中含有上百种蛋白质，这给单克隆抗体的纯化带来很大麻烦，而未纯化的含有异种蛋白质的单克隆抗体用于动物治疗可诱发变态反应，另外，血清来源有限，且每批血清之间质量差异较大，直接影响结果的稳定性，同时血清是杂交瘤细胞发生支原体污染的最主要来源之一，而且价格较贵，为了克服血清的这些缺点，采用无血清培养基培养杂交瘤细胞越来越受到广泛的重视。
无血清培养的实质就是用各种不同的添加剂来代替血清，然后进行杂交瘤细胞的培养。目前已报道的各类无血清培养基包括含有大豆类脂的、含有酪蛋白的、化学限定性的、无蛋白质的、含有血清低分子质量成分的无血清培养基，其中部分已有产品出售。综合这些无血清培养基，约有几十种不同的添加剂可用于无血清培养基，在其中至少必须添加胰岛素、转铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸钠这四种成分，才能起到类似血清的作用，其他较重要的添加剂包括白蛋白、亚油酸和油酸、抗坏血酸以及锰等一些微量元素。
采用无血清培养基培养杂交瘤细胞制备单克隆抗体，有利于单克隆抗体的纯化，有助于大规模生产，可减少细胞污染的机会，且成本较低。但无血清培养细胞的生产率低、细胞密度小，影响单克隆抗体的产量；无血清培养基还缺少血清中保护细胞免受环境中蛋白酶损伤的抑制因子等。尽管如此，无血清培养基最终会成为杂交瘤细胞培养的理想的培养基。
二、单克隆抗体的纯化技术
（一）单克隆抗体的预处理
在单克隆抗体纯化之前，均需对腹水进行预处理，其目的是为了进一步除去细胞及其残渣、小颗粒物质以及脂肪滴等。常用的方法有二氧化硅吸附法、过滤离心法以及混合法，以二氧化硅吸附法处理效果为佳，而且操作简便。
1.二氧化硅吸附法
取新鲜采集的腹水（或冷冻保存的腹水），2000r／min离心15min，除去细胞成分（或冷冻保存过程中形成的固体物质）等；取上层清亮的腹水，加入等量pH 7.2的巴比妥缓冲盐水（VBS、0.004mol／L巴比妥、0.15mol／L NaCl、0.8mmol／L Mg2＋、0.3mmol／L Ca2＋）；然后在每10mL稀释腹水中加150mg二氧化硅粉末，混匀，悬液在室温下培养30 min，不时摇动；2000g离心20min，脂质等被通过该法除去，即可得澄清的腹水。
2.过滤离心法
用微孔滤膜过滤腹水，以除去较大的凝块及脂肪滴；4℃高速（10000g）离心15min，除去细胞残渣及小颗粒物质。
3.混合法
即上述两法的组合，先将腹水高速离心，取上清液，再用二氧化硅吸附处理。
（二）单克隆抗体的粗提
1.硫酸铵沉淀法
（1）饱和硫酸铵溶液的配制。
将500g硫酸铵加入500mL蒸馏水中，加热至完全溶解，室温过夜，析出的结晶任其留在瓶中。临用前取所需的量，用2mol／L NaOH溶液调节pH值至7.8。
（2）盐析。
吸取10mL处理好的腹水，移入小烧杯中，在搅拌下滴加饱和硫酸铵溶液5.0mL；继续缓慢搅拌30min；10000r／min离心15min；弃去上清液，沉淀物用1／3体积饱和硫酸铵溶液悬浮，搅拌30min，同法离心；重复前一步1～2次；沉淀物溶于1.5mL PBS（0.01mol／L，pH7.2）或Tris-HCl缓冲液中。
（3）脱盐。
常用柱层析法或透析法脱盐。柱层析法是将盐析样品过Sephadex G-50层析柱，以PBS或Tris-HCl缓冲液作为平衡液和洗脱液，流速为1mL／min。第一个蛋白质峰即为脱盐的抗体溶液。透析法是将透析袋于2%NaHCO3、1mmol／L EDTA溶液中煮10 min，用蒸馏水清洗透析袋内外表面，再用蒸馏水煮透析袋10min，冷至室温即可使用（可置于0.2mol／L EDTA溶液中，4℃保存备用）。将盐析样品装入透析袋中，对50～100倍体积的PBS或Tris-HCl缓冲液透析（4℃）12～24h，其间更换5次透析液，用奈氏试剂（碘化汞11.5g、碘化钾8g，加蒸馏水50mL，待溶解后，再加20%NaOH溶液50mL）检测，直至透析外液无黄色物形成为止。
2.辛酸-硫酸铵沉淀法
该法简单易行，适合于提纯IgG1和IgG2b，但对IgG3和IgA的回收率及纯化效果差。其主要步骤如下：取1份预处理过的腹水，加2份0.06mol／L pH 5.0的醋酸缓冲液，用1 mol／L HCl溶液调节pH值至4.8；按每毫升稀释腹水加11μL辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，于30min内加完，4℃静置2h，15000g离心30min，弃沉淀；上清液经尼龙筛（125μm）过滤，加入1／10体积的0.01mol／L PBS，用1mol／L NaOH溶液调节pH值至7.2；在4℃下加入饱和硫酸铵溶液至45%饱和度，作用30min，静置1h；10000g离心30min，弃上清液；沉淀溶于适量PBS（含137mmol／L NaCl、2.6mol／L KCl、0.2 mmol／L EDTA）中，对50～100倍体积的PBS透析，4℃过夜，其间换透析液3次以上；取出，10000g离心30min，除去不溶性沉渣，测定蛋白质含量后，分装，冷冻保存备用。
3.优球蛋白沉淀法
该法适用于IgG3和IgM型单克隆抗体的提取，所获制品的抗体活性几乎保持不变，对IgG3单克隆抗体的回收率高于90%，对IgM单克隆抗体的回收率为40%～90%。其操作步骤如下：取一定量的预处理过的腹水，先后加入NaCl和CaCl2，使各自的浓度分别达0.2mol／L和25mmol／L，随之可见纤维蛋白产生；经滤纸过滤后，滤液对100倍体积的去离子水透析，4℃透析8～15h（若是IgG3单克隆抗体，也可室温下透析2h），其间换水1～2次；取出后22000g离心30min，弃上清液；将沉淀溶于pH 8.0的含1mol／L NaCl和0.1mol／L Tris-HCl的溶液中，重复上述的透析与离心；将沉淀的优球蛋白浓度调至5～10mg／mL，分装，冷冻保存，备用。
（三）单克隆抗体纯化的方法
单克隆抗体纯化的方法有很多种，应根据单克隆抗体的特性和实验条件选择适宜的方法，常用的技术有DEAE离子交换层析柱纯化方法、凝胶过滤法和亲和层析法三种。
1.DEAE离子交换层析柱纯化方法
（1）材料。
①20mmol／L pH 7.8～7.9Tris-HCl缓冲液，20mmol／L NaCl。
②20mmol／L pH 7.8～7.9Tris-HCl缓冲液，40mmol／L NaCl。
③20mmol／L pH 7.8～7.9Tris-HCl缓冲液，80mmol／L NaCl。
④20mmol／L pH 7.8～7.9Tris-HCl缓冲液。
⑤饱和硫酸铵液。
⑥DEAE-纤维素柱。
（2）操作方法。
①小鼠腹水用冷PBS稀释4倍后，10000r／min离心30min，去沉淀。
②在4℃上清液中缓缓滴加饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱和度为50%。
③将此溶液置于冰中30～60min，然后5000r／min离心10min，去上清液。
④将沉淀溶于Tris-HCl缓冲液（40mmol／L NaCl）中（溶液可能混浊）。
⑤装入透析袋于Tris-HCl缓冲液（20mmol／L NaCl）中透析除盐。
⑥离心去沉淀。
⑦溶液稀释（1∶100或更高倍稀释）后，于280nm波长处测蛋白质含量，估计蛋白质质量。1个吸光度（A280nm）单位相当于0.8mg蛋白质。
一般每毫升腹水中，含有总蛋白质25～36mg。
⑧过DEAE-纤维素柱：柱高40cm，以Tris-HCl缓冲液（20mmol／L NaCl）平衡。透析样品以Tris-HCl缓冲液等量稀释。
样品进入柱床速度为1～2mL／min，以NaCl线性梯度洗脱。大部分单克隆IgG于40 mmol／L和80mmol／L NaCl洗脱，也有极少量的单克隆抗体于120～150mmol／L NaCl洗脱。
测A280nm，收集蛋白质峰对应组分，将单克隆IgG保存，备用。
2.A蛋白亲和层析法
A蛋白是金黄色葡萄球菌的表面蛋白，相对分子质量为42000，有6个不同的IgG结合位点。其中有5个位点对IgG的Fc片段显示出很强的特异性亲和力，不同的位点独立地与抗体结合。但IgA、IgM、IgE也可能结合在配体上，当达到饱和时，一个A蛋白分子至少可以结合两个IgG分子。A蛋白对IgG有高亲和力和特异性，这一特点使之非常适用于纯化腹水或细胞培养上清液中的单克隆抗体。
下面为应用A蛋白-Sepharose CL-4B亲和层析法纯化单克隆抗体，用AKTA explorer100进行监测。
（1）腹水的处理。
取腹水，在4℃、12000g条件下离心15min，以除去较大的凝块。
（2）装柱。
将1.5g A蛋白-Sepharose CL-4B干粉用6～7mL三蒸水溶解，再用0.02mol／L、pH 7.4的磷酸盐缓冲液（上样缓冲液）浸泡15min，然后装入层析柱中。
（3）平衡。
用10倍柱床体积的上样缓冲液过柱，流速为1mL／min，用pH试纸测试流出液体的pH值为7.4。
（4）上样。
取预处理过的腹水5mL，用上样缓冲液稀释至50mL，用0.45μm的滤膜过滤，上样，流速为1mL／min。
（5）洗脱。
用上样缓冲液进行流洗，10倍柱床体积，流速为1mL／min。随后用0.02mol／L、pH 4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，同时应用AKTA explorer100进行监测，当观察到基线开始上升，即出现洗脱峰时，取干净的5mL离心管收集，每收集3mL后，立即用1mol／L、pH 9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH值至7.0。
（6）平衡。
收集洗脱液至回到基线后，继续用5～10倍柱床体积上样缓冲液平衡，流速调至1 mL／min。再用10倍柱床体积三蒸水平衡。
三、单克隆抗体的应用
单克隆抗体以其特异性强、纯度高、均一性好等优点，广泛应用于淋巴细胞的鉴别、病原体的鉴定、肿瘤的诊断和分型以及体内激素含量的测定等，其应用很大程度上促进了商品化试剂盒的发展。但是单克隆抗体对抗原的识别与多克隆抗体有很大的不同。不同试剂盒因使用的单克隆抗体不同，识别抗原的位点不同，导致检测结果有一定差异。因此，标准化问题还需要进一步研究。
（一）诊断各类病原体
这是单克隆抗体应用最多的领域，已有大量诊断（检测）试剂供选择，如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单克隆抗体所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生命周期的抗原性等方面具有独特优势。
（二）检测肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原
肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测可用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单克隆抗体，但对肿瘤相关抗原（如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原）的单克隆抗体早就用于临床检验。
随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已建立，这为肿瘤的早期诊断及阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单克隆抗体检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单克隆抗体可用于体内诊断，再结合X射线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。
（三）检测淋巴细胞表面标志
淋巴细胞表面标志的检测可用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如，检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T淋巴细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单克隆抗体对其进行位点检测可得到更可信的结果。
（四）测定机体微量成分
应用单克隆抗体结合其他技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12 g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其他生化物质。单克隆抗体在这一领域的应用主要是利用单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分的原理。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH值，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。如用抗人绒毛膜促性腺激素（hCG）亲和层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其他提取方法（沉淀法、高效疏水色谱法等）相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。这对受检者健康状态判断与疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。
（五）临床治疗
单克隆抗体在临床上用于以下几个方面：
（1）移植物受者使用T淋巴细胞的单克隆抗体，可预防急性排斥反应；
（2）供体骨髓在体外经T淋巴细胞的单克隆抗体处理，可减轻或消除移植物抗宿主反应；
（3）艾滋病治疗；
（4）肿瘤介入治疗，即将细胞毒剂（药物）与抗肿瘤抗原的单克隆抗体结合后，利用单克隆抗体的导向作用，将细胞毒剂（药物）定位于肿瘤细胞，达到直接杀死肿瘤细胞的目的。
（六）其他研究价值
单克隆抗体具有高度的特异性和敏感性，它好像分子刀一样，能够剖析任何一种抗原物质的微细结构，它又具有均质的特点，故利用单克隆抗体能更深刻、更全面地分析抗原构造，特别是对细胞表面的小分子抗原的分析更有意义。目前国外已有几个系列的产品，例如最常用的OKT和抗Leu系列，用于分析白细胞的表面抗原。OKT是英文缩写，“O”指美国Ortho公司，“K”指研制者的姓（Kung、龚氏，美籍华人），“T”指T淋巴细胞，根据T淋巴细胞膜抗原的特异性编号，如OTK1、OTK3、OTK4等。抗Leu系列是美国Becton Dickinson公司生产的抗人白细胞单克隆抗体，其中抗Leu1～Leu6可检测T淋巴细胞表面不同的膜抗原。临床上使用这类T淋巴细胞单克隆抗体来测定血液、渗出液和组织切片中T淋巴细胞及其亚群的数量、比值以及是否处于激活状态等。
单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位（即抗原决定簇）相结合，利用这一特性可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而可从理论上阐明其机理。
知识拓展
单克隆抗体特异性强、灵敏度高，在兽医临床诊断上优于现有的抗血清，采用已知的单克隆抗体与动物未知抗原发生特异性结合，可快速、简便而又准确地检测出肿瘤、过敏性疾病、内分泌病、血液病、寄生虫病、病毒病、细菌性疾病等病原的特异性抗原而加以确诊。单克隆抗体与多种免疫组织化学方法（如免疫荧光法、免疫酶法、免疫胶体金法及放射自显影法等）联合应用可以特异性地识别病原，准确地对病原或病变组织的抗原进行定性、定位甚至定量分析。
单克隆抗体在动物传染病治疗中的应用途径主要有三种。第一种是将单克隆抗体直接注入动物体以治疗疾病，在免疫学上称为人工被动免疫。单克隆抗体与病变细胞结合后，通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）或者形成抗原抗体复合物激活补体来杀伤靶细胞，从而达到治疗效果。第二种是抗体导向药物治疗，利用具有高度特异性的单克隆抗体作为载体，与对病原或肿瘤细胞具有很强杀伤作用的药物、干扰素、毒素、放射性核素或肿瘤坏死因子等偶联，将其携带至病灶局部，可以特异性地杀灭病原或杀伤肿瘤，同时能降低对正常组织细胞和宿主的损害作用，常被形象地称为“生物导弹”，此方法在癌症治疗上很有前景，现已成为抗体工程的研究热点。第三种是通过阻断或中和作用产生治疗效果。临床应用中大多数是自体免疫和免疫抑制，表现出的机制为阻断或调节反应。
思考题
1.试述杂交瘤细胞的无血清培养的发展和优缺点。
2.简述大量制备单克隆抗体的方法。
3.简述A蛋白亲和层析法纯化单克隆抗体的方法。
4.单克隆抗体的应用领域有哪些？
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