活鉴别试验

项目七　培养细胞的死、活鉴别试验

一、项目背景

在细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况，经常测定细胞的存活率，死、活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义。任何培养瓶内生长的细胞都由死细胞和活细胞组成，从形态上区别死、活细胞是困难的。不同的死、活细胞鉴定方法有各自具体的反应机理，但无论采用何种办法，都是利用了死、活细胞在生理机能和性质上的差异。当细胞死亡时，某些染料能透过变性的细胞膜，与解体的细胞核DNA结合，使其着色，从而可以鉴定死细胞与活细胞。常用的染料有台盼蓝、苯胺黑等。

二、项目目标

（1）掌握培养细胞的死、活鉴别的原理与操作方法；

（2）熟练掌握染液的配制方法与细胞计数的方法；

（3）能针对实验结果，对细胞的生长情况进行分析。

三、工作流程

流程一：工作准备

续表

流程二：台盼蓝法

将0.5g台盼蓝加热溶解于100mL BSS（pH 7.2～7.4）中，过滤后使用。细胞悬液和染液按1∶1体积比混合后，加盖玻片，1～3min内计数100～200个细胞。活细胞圆形透明，死细胞染成蓝色，用活细胞占计数细胞的百分比表示细胞活力。

细胞活力＝活细胞数／（活细胞数＋死细胞数）×100%

流程三：苯胺黑（aniline black）法

苯胺黑对细胞毒性小，被染活细胞可以坚持数小时不被裂解杀死。此法常用在微量细胞毒性试验中，能较准确地测定巨噬细胞的活性，其缺点是细胞对苯胺黑的摄取比台盼蓝的慢，黑色的死细胞与未处于焦点的活细胞（不着色）易混淆。

1%苯胺黑液用含小牛血清的BSS或0.9%生理盐水配制，过滤后使用。使用时，将细胞悬液与2～10倍体积的0.1%苯胺黑液混合，静置5～10min后，观察计数，死细胞染成黑色，活细胞不着色。

流程四：伊红Y（eosin Y）法

将细胞悬液与7倍量0.15%伊红液混合，2min后观察，死细胞为桃红色，活细胞不着色。

流程五：结晶紫法

将细胞悬液与0.1%结晶紫液等量混合后，立即镜检，着色的为活细胞。

死、活细胞的鉴别如图3-1所示。

图3-1　死、活细胞的鉴别

（a）台盼蓝染色（死细胞蓝色）；（b）伊红Y染色（死细胞桃红色）；（c）结晶紫染色（活细胞紫色）

四、工作注意事项

（1）细胞活性鉴别试验不能区别10%～20%的细胞活力差异；

（2）活细胞可能不贴壁或不能长时间生存和繁殖；

（3）正常活细胞和凋亡细胞不能区分；

（4）台盼蓝法、苯胺黑法适合细胞活性计数研究，实验细胞悬液浓度为（2～20）×10⁶个／L。

五、思考题

（1）台盼蓝法的机理是什么？

（2）伊红Y法中观察死细胞是桃红色、活细胞不着色，为什么？