转基因动物与基因打靶

第五节　转基因动物与基因打靶

基因打靶（gene targeting）包括基因敲除（gene knockout）和基因敲入（gene knockin），基本原理是利用外源DNA分子与染色体DNA间的同源重组精确，而定点地将细胞内染色体上的某一特定基因的功能破坏（沉默）——敲除，或通过同源重组向细胞内染色体上引入一个有功能的新基因——敲入（图17－4）。基因打靶是在胚胎干细胞技术和同源重组技术上发展起来的，具有专一性强、打靶后的基因片段可以与染色体DNA一起共同稳定遗传的特点，已经成为一种较为理想的改造生物遗传物质的实验方法。

图17－4　基因打靶载体作用示意图

基因敲除技术早在20世纪70年代就在酿酒酵母中应用，胚胎干细胞技术的出现为基因敲除提供了更为合适的操作对象，1985年Smithies第一次将一段质粒插入到人染色体的β^－珠蛋白位点，并于2年后获得基因敲除小鼠，2000年获得基因打靶绵羊，2002年获得了基因打靶猪。

基因打靶的必备条件是打靶胚胎干细胞（保留细胞全能性、可以在体外培养和遗传操作）和构建打靶载体（新霉素阳性筛选标志和单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶HSV－tk阴性筛选标志）。打靶载体通常都包含有两段与打靶目标位点两端同源的区域，中间一段不同且为目的序列，并带有某种药物筛选标记。打靶载体构建的基本策略见表17－3。

表17－3　打靶载体构建的基本策略

基因打靶的基本程序为：构建打靶载体、打靶载体导入ES细胞进行重组置换、将基因打靶的ES细胞注射到打靶动物胚胎的胚泡、将注射过基因打靶ES细胞的胚泡移植到假孕的打靶动物子宫、嵌合体打靶动物杂交育种获得基因打靶的转基因动物。

1993年顾华等提出利用Cre－LoxP系统进行组织特异性基因敲除，系统包括Cre重组酶和LoxP位点两部分，前者由大肠杆菌噬菌体P₁的Cre基因编码，后者是13bp的反向重复顺序和8bp的间隔区构成，Cre重组酶可介导34bp的重复单元，切除同向重复的2个LoxP位点间的DNA片段和1个LoxP位点，保留1个LoxP位点。Cre－LoxP组织特异性基因敲除基本过程见图17－5。

图17－5　利用Cre－LoxP系统进行细胞类型特异性基因敲除

有2种操作方法使用Cre－LoxP系统，一是构建打靶载体时将标记基因放在靶基因内部，标记基因两侧放上相同方向排列的LoxP序列，可以在细胞水平用Cre重组酶表达质粒转染被打靶的细胞，通过识别LoxP位点将抗性基因切除；二是在个体水平将打靶杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可以得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。

通过基因打靶技术，已经建立了许多针对不同靶基因的基因敲除的转基因动物模型，就基因敲除小鼠，目前已达数千种，每年还以数百种的速度在增加。基因打靶将是功能基因组研究最直接有效的手段之一，基因打靶在疾病与临床研究、异种器官移植、动物育种和转基因动物研究等领域得到了广泛应用。