实验项目四 血糖浓度测定
学习目标
【知识目标】
（1）能用自己的语言描述用邻甲苯胺法及葡萄糖氧化酶法检测血糖浓度的原理。
（2）能够迅速而准确地陈述检测血糖浓度的操作要点。
（3）能够准确描述比色法的原理。
【能力目标】
（1）能在规定时间内完成血糖浓度测定的各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。
（2）能熟练使用分光光度计、半自动生化分析仪。
（3）能准确判断检测的血糖浓度是否在正常范围内，鉴别低血糖及高血糖。
案例引导
患者，男，66岁，近来嗜睡、疲乏无力，视力模糊，排尿量增多，并伴有头痛、口苦、呼气有异味，近来消瘦比较明显。实验室检查结果显示：血糖7.6mmol/L，酮体5.2mmol/L，尿糖（＋＋＋），尿蛋白（＋）。试解释检查结果，并初步诊断其可能患有何种疾病？
（提示：糖尿病）
血液中所含的葡萄糖，称为血糖。它是糖在体内的运输形式。糖类是机体重要的供能物质，也是人体结构的重要组成物质之一。血糖浓度检测可以反应人体体内糖代谢水平。目前，国内医院多采用邻甲苯胺法和葡萄糖氧化酶法测定血糖浓度。
一、邻甲苯胺法
【实验原理】
（1）本实验采用邻甲苯胺法测定血糖浓度。在邻甲苯胺法测定过程中，由于血中绝大部分非糖物质及抗凝剂中的氧化物同时被沉淀下来，因而不易出现假性、过高或过低情况，结果较可靠。其原理是葡萄糖在酸性介质中加热脱水，反应生成5－羟甲基－2－呋喃甲醛（又称为羟甲基糠醛），分子中的醛基与邻甲苯胺缩合成蓝色（青色）的醛亚胺，在一定浓度范围内，此颜色的深浅与葡萄糖的含量呈正比，通过比色分析法可以定量。
（2）比色分析法是以生成有色产物的显色反应为基础，通过比较或测定有色产物溶液颜色深浅度来确定待测物含量的方法。有些被检测的物质溶液本身就具有颜色，而有些物质虽不具有颜色，但可在试样中加入某种适宜的试剂，使其产生有色化合物，溶液颜色的深浅与试样中该化学成分的含量呈正比。借助于光电比色计和分光光度计，在相同条件下对两个性质相同而浓度不同的溶液进行测定，将未知含量的有色溶液和已知含量的有色溶液进行比色，通过计算就可求出未知溶液的含量。本实验中，样本血清中的葡萄糖按上述原理发生颜色反应后，与同样处理的已知浓度的标准葡萄糖进行比色测定，可测得样本的血糖浓度。
【实验器材】
试管，试管架，吸量管，试管夹，721型分光光度计，电热恒温水浴箱，记号笔，普通台式离心机，大烧杯，比色杯。
【药品及试剂】
血清，蒸馏水，邻甲苯胺试剂，葡萄糖标准储存液，葡萄糖标准应用液。
【试剂配制】
1.邻甲苯胺试剂
称取硫脲2.5g，溶解于750mL冰醋酸中，再将此溶液移入1000mL容量瓶内，加邻甲苯胺150mL及2.4%硼酸100mL，然后加冰醋酸至所需刻度。将配制好的溶液置于棕色瓶中，至少可用2个月。
2.55.56mmol/L葡萄糖标准储存液
准确称取干燥纯葡萄糖1000mg，用2.5g/L苯甲醛50mL溶解，移入100mL容量瓶中，加2.5g/L苯甲醛溶液至所需刻度。此液可在冰箱内久存。
3.5.56mmol/L葡萄糖标准应用液
吸取标准葡萄糖储存液10mL于100mL容量瓶中，用2.5g/L苯甲醛溶液稀释至刻度。
操作流程
【操作步骤】
1.样品制备
直接采用非抗凝血分离血清或采集抗凝血样品，以3000r/min的离心速度离心，10min即可分离。
2.显色反应
取10mL试管3支，标号，按表3－3加入溶液。
表3－3 邻甲苯胺法检测血糖浓度显色反应操作步骤（单位：mL）
混合均匀，将各试管置于电热恒温水浴箱中煮沸20min，取出后冷却。
3.比色测定
用721型分光光度计在630nm波长以下时，可使用光径为1.0cm的比色杯。以空白管调零，分别读取样品管和标准管的吸光度值A。
【实验数据处理及结果分析】
用下列公式计算血糖浓度：
【注意事项】
（1）邻甲苯胺具有毒性和腐蚀性，操作时要注意。
（2）本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与糖醛起反应，不与血中其他还原物质起反应。
（3）显色反应与水的含量有关，故应使标准管和样品管的含水量一致。
（4）温度对显色反应有明显影响，煮沸时间和温度应准确控制。
（5）显色后颜色不稳定，室温每放置1min，颜色降低0.15%。
（6）邻甲苯胺试剂中冰醋酸浓度很高，若使用不当容易损坏比色仪器。
（7）离心机的使用：
①离心前一定要配平（包括位置配平和重量配平）。
②使用时离心机的盖子一定要盖紧，以免发生意外。
③要等离心机完全静止后才能打开盖子。
【实验意义】
正常值：健康成年人空腹血清葡萄糖浓度为3.9～6.4mmol/L。
二、葡萄糖氧化酶法
【实验原理】
葡萄糖氧化酶法（GOD－PAP）相较于邻甲苯胺法，具有特异性强、价格低廉、方法简单等特点。GOD－PAP建立在1969年出现的Trinder法基础之上。
在pH值为7.0的条件下，葡萄糖可由葡萄糖氧化酶（GOD）氧化成葡萄糖酸（D－葡萄糖酸－δ内酯）及过氧化氢，后者在过氧化物酶（POD）的作用下，与苯酚及色原性受体4－氨基安替吡啉（4－AAP）作用，过氧化物酶催化过氧化氢，氧化色原物质，生成红色醌亚胺化合物，在505nm处有最大吸收峰。醌亚胺的生成量（颜色深浅）与葡萄糖量（浓度）呈正比，可求得血样中葡萄糖含量。用本法测定的葡萄糖具有高度特异性，更能反映血中葡萄糖的真实含量，是科研工作中常用的葡萄糖测定方法。随着试剂药盒的推广普及，此法也已广泛应用于临床检测。其反应过程如下：
【实验器材】
试管，试管架，微量加样器，半自动生化分析仪（或分光光度计），记号笔，37℃恒温水浴箱。
【药品及试剂】
（1）新鲜无溶血血清。
（2）有商品试剂盒供应，试剂盒的主要成分与实验浓度如表3－4所示。
表3－4 葡萄糖氧化酶法某试剂盒的主要成分与实验浓度
【试剂配制】
推荐使用有批准文号的优质市售试剂盒。以下试剂配制仅供参考。
1.0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH＝7.0）
溶解无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5.3g于800mL蒸馏水中，用1 mol/L氢氧化钠或盐酸调节至pH值为7.0，然后用蒸馏水稀释至1L。
2.酶试剂
取葡萄糖氧化酶1200U，过氧化物酶1200U，4－氨基安替吡啉10mg，加上述磷酸盐缓冲液至80mL左右，调节至pH值为7.0，再加磷酸盐缓冲液至100mL，置于冰箱中保存。至少可稳定3个月。
3.酚溶液
将重蒸馏酚100mg溶于100mL蒸馏水中，储存于棕色瓶内。
4.酶酚混合试剂
酶试剂及酚溶液等量混合，储存于棕色瓶内。在冰箱中可以存放1个月。
5.12mmol/L苯甲酸溶液
于900mL蒸馏水中加入苯甲酸（MW＝122.12）1.46g，加热助溶，冷却后置于1 L容量瓶中，加蒸馏水至所需刻度。
6.葡萄糖标准储存液（100mmol/L）
称取标准纯度的无水葡萄糖（MW＝180.16，预先置于80℃烤箱内干燥恒重后，再移置于干燥器内保存）1.802g，用12mmol/L苯甲酸溶液溶解后转移到100mL容量瓶内，再以12mmol/L苯甲酸溶液稀释至100mL刻度处，至少放置2h后方可使用。
7.葡萄糖标准应用液（5mmol/L）
吸取葡萄糖标准储存液5mL，置于100mL容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至所需刻度，混匀。
操作流程
【操作步骤】
1.工作液配制
将10mL R1与90mL R2混合均匀，即为工作液。
2.半自动生化分析仪设置
参数设置→反应液准备→校准→质控。
3.显色反应
取试管3支，分别标以1、2、3号，按表3－5进行操作。
表3－5 葡萄糖氧化酶法检测血糖浓度反应操作步骤（单位：mL）
分别混匀，置于37℃恒温水浴箱中，保温10min（应避免阳光直射）。
4.比色测定
半自动生化分析仪（或分光光度计）设置波长为505nm，以空白管调零，分别读取吸光度值A标准和A样品或浓度。
【实验数据处理及结果分析】
如读取吸光度值A，则按下式计算结果：
【注意事项】
（1）酶酚混合液和样品的用量可根据需要按比例改变，计算公式不变。
（2）因缓冲液中含有有毒的稳定剂叠氮钠，应避免与皮肤接触。
（3）酚试剂有毒，切勿吞咽。如果试剂溢出，请用大量水冲洗被污染的部位。
（4）使用完1mL血清吸管后应立即洗净，以免血清凝固在细管内。
（5）本产品应在2～8℃条件下储存。
【实验意义】
1.正常值
健康成年人空腹血清葡萄糖浓度为3.89～6.11mmol/L（或参考试剂盒提供的参考范围）。
2.意义
机体从碳水化合物的代谢中获得血糖。葡萄糖是人体血液中最重要的单糖，血糖是维持细胞功能的能量供体。血糖浓度受神经系统和激素的调节而保持相对稳定，当这些调节失去原有的相对平衡时则出现糖代谢紊乱。检测葡萄糖的浓度对于糖代谢紊乱相关疾病的诊断、治疗等具有重要的意义。
（1）高血糖：空腹血糖浓度高于7.0mmol/L。
①生理性或暂时性血糖浓度升高：注射葡萄糖或摄入高糖食物后、情绪紧张肾上腺素分泌增加时可导致生理性血糖浓度升高，但不应超过10mmol/L。呕吐、腹泻、高热等引起脱水可致血糖浓度轻度升高，为暂时性血糖浓度升高。
②病理性高血糖：内分泌腺功能障碍能引起高血糖，如果胰腺β细胞损害或胰岛素分泌不足导致胰岛素缺乏，血糖浓度可超过正常范围，临床上称为糖尿病。内分泌疾病引起的各种对抗胰岛素的激素分泌增加也会出现高血糖，如甲状腺功能亢进、垂体前叶嗜酸性细胞腺瘤、肾上腺皮质功能亢进、嗜铬细胞瘤、垂体前叶嗜碱性细胞机能亢进症等。
此外，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等引起的颅内压增高刺激血糖中枢也可导致高血糖。
（2）低血糖：空腹血糖浓度低于3.0mmol/L。
①生理性或暂时性低血糖：饥饿、剧烈运动、注射胰岛素后，妊娠和服用降糖药后等都会导致低血糖。脑组织首先对低血糖作出反应，表现为头晕、心悸、出冷汗和饥饿等症状，严重时可发生低血糖昏迷。
②病理性低血糖：胰岛β细胞发生器质性病变，胰岛素分泌过多或治疗时使用胰岛素过多；对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退，肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少；严重的肝脏疾病患者由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖，这些均可导致低血糖。此外，糖原储积症、新生儿低血糖、自身免疫性疾病患者也易于出现低血糖。
能力检测
一、单项选择题
1.分光光度法（比色法）的理论基础为（ ）。
A.朗伯－比尔定律 B.Nernst方程式 C.Rayleigh方程式
D.Heidelberger曲线 E.以上均不是
2.正常成人空腹血糖浓度（葡萄糖氧化酶法）参考值是（ ）。
A.3～6mmol/L B.3.89～6.11mmol/L C.7.0mmol/L
D.9.0mmol/L E.3.18～6.01mmol/L
3.下列关于低血糖的叙述错误的是（ ）。
A.血糖浓度低于3.0mmol/L即可诊断
B.临床症状主要是与交感神经和中枢神经系统机能的异常相关
C.经典的诊断试验是72h禁食试验
D.由多种因素引发
E.糖尿病患者的发病率较高
4.高血糖的判断标准是空腹血糖（葡萄糖氧化酶法）浓度（ ）。
A.为3.89～6.11mmol/L B.为8.9～10.0mmol/L C.高于6.1mmol/L
D.高于7.0mmol/L E.高于11.1mmol/L
5.目前，血糖浓度测定的常规方法是（ ）。
A.葡萄糖脱氢酶法 B.己糖激酶法 C.葡萄糖氧化酶法
D.邻甲苯胺法 E.6－磷酸葡萄糖脱氢酶法
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