质粒的酶切与鉴定

质粒的酶切与鉴定_生物化学实验技术

实验项目十九　质粒的酶切与鉴定

学习目标

【知识目标】

（1）能用自己的语言描述质粒的酶切与鉴定的原理。

（2）能够迅速而准确地陈述质粒的酶切与鉴定的实验操作要点。

（3）能够准确鉴别质粒的酶切与鉴定的结果，并能说明其意义。

【能力目标】

（1）能够正确完成各项操作内容，做到步骤正确、动作连贯协调、内容全面无遗漏。

（2）能够正确分析质粒的酶切与鉴定的结果。

案例引导

能通过携带抗原基因且在体内表达抗原蛋白，并引起免疫应答的重组DNA称为核酸疫苗。核酸疫苗在设计、工艺流程、安全性、稳定性、免疫效果等方面有着传统疫苗难以企及的优势。通过限制性内切酶等基因工程工具获取携带抗原基因的DNA片段，通过一定的载体工具将获取的抗原基因带入宿主细胞进行表达，从而获得免疫效果。请结合所学知识，思考这种可以携带基因进入细胞的工具是什么。

（提示：质粒）

【实验原理】

DNA限制性内切酶消化是基因分析中的关键步骤，内切酶是最关键的工具酶。核酸限制性内切酶，是一类能识别和切割双链DNA分子内特定碱基顺序的核酸分解酶。可将其分为3型，其中Ⅱ型因具有特异的切割点且酶蛋白不具有甲基化作用，因此最为常用。

由于DNA分子的核苷酸顺序是一定的，某种限制酶用于DNA的切点数也是一定的，故所得的DNA层段和片段大小也一定。通过电泳和溴化乙锭染色后，测出各DNA片段移动的位置和距离，从而推断DNA的性状。

影响酶解的因素很多，它们会干扰对DNA性状的分析，甚至导致错误的分析。其中，最主要的影响因素是DNA的纯度，因此必须就DNA的纯度、浓度和相对分子质量加以测定，以便进行下一步的酶切、连接和转化实验。测定方法通常采用以下两种。

1.紫外分光光度法

根据计算在260nm波长下，每毫升1μg DNA钠盐溶液的OD值为0.020，即在OD₂₆₀＝1时，双链DNA含量为50μg/mL，单链DNA与RNA含量为40μg/mL。

根据经验数据，纯核酸溶液OD_280nm/OD_260nm＝0.5，即当样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.8～2.0时，认为已达到所要求的纯度。

2.琼脂糖凝胶电泳法

溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光。当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时，加入的溴化乙锭（EB）就插入DNA分子中形成荧光络合物，使发射的荧光增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量，如将已知浓度的标准样品作电泳对照，就可估计出待测样品的浓度。

在凝胶电泳中，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值呈反比关系。凝胶电泳可以分离不同的DNA分子。在一般情况下，超螺旋状（SC）分子迁移速度最快，其次为线性（L）分子，最慢的为开环状（OC）分子，所以凝胶电泳也可以鉴别相对分子质量相同但构型不同的DNA分子。

在提取到的质粒DNA样品中，如混杂有染色体DNA或RNA，则在琼脂糖凝胶电泳上也可以分别观察到电泳区带，由此可分析样品的纯度。将纯品质粒DNA与含有杂质DNA、RNA的样品做电泳图谱比较（图3－9）。

图3－9　质粒酶切后琼脂糖凝胶电泳结果

至于纯品质粒DNA中为何出现两条区带，一般认为，按目前的技术水平无论怎样提取，结果都会夹一些开裂一个链的开环状质粒，它在电泳图谱中滞后于超螺旋状质粒，故形成两条区带。也有学者认为前区带为单体超螺旋结构质粒，后区带为二聚体超螺旋结构质粒。无论何种解释，它们进行单一酶切位点的限制内切酶酶解后，都只形成一条线性DNA的区带。

【实验器材】

水平电泳槽，电泳架，梳子，紫外透射分析仪，Eppendorf管，Tip头，可调移液器，恒温水浴箱。

【药品及试剂】

琼脂糖，酶2U/μL，EB。

【试剂配制】

（1）5×TBE：Tris 54g、硼酸27.5g 0.5mol/L、EDTA（pH＝8.0），1mol/L EDTANa₂（pH＝8.0）加水至1000mL，同前稀释5倍。

（2）琼脂糖凝胶：用1×TBE配制0.8%的凝胶。

（3）1×TE缓冲液（pH＝8.0）：10mmol/L Tris－HCl（pH＝8.0），1mmol/L EDTANa₂（pH＝8.0）。

操作流程

【操作步骤】

1.质粒的限制内切酶消化

取3支Eppendorf管分别装入样品，按表3－29的操作流程进行。

表3－29　质粒的限制内切酶消化操作流程（单位：μL）

要点：（1）加样器的使用。

（2）盐与酶相匹配。

（3）做好标记，并做实验记录。

（4）在低温下加样，尤其添加质粒和酶要在冰盒中进行，且要最后加酶。样品混匀后离心，务必使所有药品充分反应，一同放入37℃恒温水浴箱中，水浴1h。

2.离心

每管中加8μL溴酚蓝，振荡混匀，以4000r/min的转速离心1min即可。

3.电泳前的准备

明确电泳槽的安装方法及电泳仪的连接。将用来铺琼脂糖凝胶的盒子洗净并擦干（包括梳子及挡板）。插上两侧挡板，用80℃以下的琼脂糖（0.8%）溶液封住挡板底部内侧，待其凝固后，用三角烧瓶盛琼脂糖热溶液并迅速将其倒入平板中央，琼脂糖高度为2.5cm左右，并插上梳子（梳子底部与玻璃板距离为1mm），凝固待用。

4.加样

将已凝固的凝胶板放入电泳槽中，拔去梳子及挡板，添加1×TBE缓冲液，使液面平齐或略高出凝胶板。选择相连六孔，依次加入AABBCC，每孔加样品20μL。

要点：加样时，端坐，两肘放在桌面，以便于平稳操作，吸取样后，将Tip头略插入孔中，不要过深，依次缓慢加样，轻轻将Tip头提出液面后再松手，以免回吸。

5.电泳

连通好电源，起始电压为40mV时工作10min，然后20mV时工作12～16.5h，切勿使溴酚蓝跑出凝胶板，以保证样品仍在凝胶板上。在学生实验过程中，由于时间关系，可加大电压，缩短时间，实验结果不会有太大偏差。

6.染色

电泳结束后，将凝胶板连同玻璃板一同放入盛有溴化乙锭染色液的托盘中，振荡染色1h。

要点：溴化乙锭是强致癌物，操作时，切记戴一次性手套。

【实验数据处理及结果分析】

1.观察结果

凝胶板从EB染色液中拿出后用清水冲净，放在紫外灯观察板上，取下玻璃板，盖上盖，开灯，从盖上观察镜中观察。

注意：紫外光对眼睛晶状体有强烈刺激作用，切勿直视紫外光时间过长。

2.记录并讨论

做好实验记录，并进行讨论。

【注意事项】

（1）EB为强诱变剂，操作时应注意安全。

（2）实验中含有EB的凝胶等实验物，不要随意倒入水池等内，要放入规定的回收地点。

【实验意义】

酶切技术是基因工程中一项重要的技术，对于基因重组等有重要的意义。同时，质粒是基因工程的一个重要载体，在转基因技术中起着重要的作用。

能力检测

一、单项选择题

1.质粒是（　　）。

A.环状双链DNA　　B.线性双链DNA

C.环状单链DNA　　D.线性单链DNA

E.环状单链RNA

2.限制性核酸内切酶可对（　　）。

A.双链DNA的特异部位进行切割　　B.单链DNA的特异部位进行切割

C.多肽链的特异部位进行切割　　　D.mRNA的特异部位进行切割

E.多肽链的非特异部位进行切割