食品卫生微生物学检验步骤

食品卫生微生物学检验步骤_微生物实验实训

任务6　食品卫生微生物学检验步骤

微生物检验的一般程序包括：样品的采集→样品的处理→样品的检验→分析结果及报告。

1．采样

在微生物检验过程中，样品的采集是很重要的一个步骤。所采集的样品必须具有代表性和均匀性，能反映全部被检样品的卫生状况，否则检验结果毫无价值。样品种类可分为大样、中样和小样三种。大样指一整批；中样是从样品各部分取得的混合样品，一般为200g；小样是指分析检验用的试样，一般为25g。采集的样品一般应一式三份，分别供检验、复验及备查使用。根据样品种类不同，采样方法、采样工具、容器及采样数量亦有所不同。

1）固体样品

（1）肉及肉制品。

生肉及脏器：刚屠宰的畜肉，可于开腔后用无菌刀取两腿内侧肌肉各150g（或劈半后取两侧背最长肌肉各150g）；若是冷藏或销售的生肉，可用无菌刀取腿肉或其他部位的肌肉250g。采集样品后放入无菌容器内，立即送检；如条件不许可时，最好不超过3h。送检时应注意冷藏，不得加入任何防腐剂。样品送往化验室应立即检验或放置于冰箱暂存。

禽类（包括家禽和野禽）：鲜、冻家禽取整只，放在无菌容器内；带毛野禽可放于清洁容器内，立即送检。

各类熟肉制品：包括酱卤肉、肴肉、熟灌肠、熏烤肉、肉松、肉脯、肉干等，一般取样250g。熟禽取整只，放在无菌容器内，立即送检。

腊肠、香肚等生灌肠：取整根、整只，小型的可采取数根或数只，其总量不少于250g。

（2）蛋制品。

鲜蛋：用流动水冲洗外壳，再用75%酒精棉球擦拭消毒后放入灭菌袋中，加封，做好标记后送检。

罐装全蛋粉、蛋黄粉、蛋白片：用75%酒精棉球对包装上的开口处进行消毒，再将盖开启，用灭菌的双套回转取样管斜角插入箱底，旋转套管收集样品，然后将样品装入灭菌广口瓶中，每个检样不少于100g。

冰全蛋、冰蛋黄、冰蛋白：先用75%酒精棉球消毒容器开口处，将盖开启，然后用灭菌电钻由顶到底斜角插入，慢慢钻取样品，然后抽出电钻，从中取出200g检样装入灭菌广口瓶中。

（3）乳制品。

常见的固态乳制品有奶粉、干酪及乳清粉等。

对原包装小于或等于500g的乳制品，取相同批次的最小零售原包装，采样量不小于5倍或5倍以上检验单位。

对于原包装大于500g的乳制品，奶粉及乳清粉采样时可将洁净、干燥的采样钻沿包装容器切口方向向下，匀速穿入底部，当到达底部时，将采样钻旋转180°，抽出采样钻并将采集的样品放入容器内。干酪采样时应根据干酪的形状和类型，分别使用以下方法采样：在距边缘不小于10cm处，将取样器向干酪中心斜插到一个平面，可进行一次或几次；把取样器垂直插入一个面，并穿过干酪中心到达对面；从两个平面之间，将取样器水平插入干酪的竖直面，再插向干酪中心；若干酪是装在桶、箱或其他大容器中，或是将干酪制成压紧的大块时，将取样器从容器顶斜穿到底进行采样。

2）液体样品

采集液体样品时，应通过振摇使样品充分混匀，再无菌操作打开包装，用100mL无菌注射器抽取，然后注入无菌盛样容器中。

3）罐头

在检验大批罐头食品时，根据厂别、商标，按品种、来源及生产时间分类进行采样；对于生产过程中的罐头食品，可按生产班次采样，每班每个品种取样基数不得少于3罐，也可按杀菌锅采样，每锅取1罐，但每批每个品种不得少于3罐；对于储存的成批罐头中有变形、膨胀、凹陷、罐壁裂缝、生锈和破损等情况时，可根据情况决定抽样数量。

4）注意事项

（1）采样的方法是随机抽样，但不等于随意取样；

（2）采样过程必须在无菌条件下进行，以防止交叉污染或二次污染，应保持样品原有的微生物状态；

（3）采样前需对采样工具和容器进行消毒；

（4）采样前后要及时贴上标签，注明样品名称、来源、数量、采样地点、采样人及采样时间等。

2．处理

样品处理也是检验工作中重要的组成部分，如果要根据一小份样品的检验结果报告一大批样品的质量，就必须采取正确的样品制备方法。样品种类繁多，不同的样品有不同的处理方法。

1）固体样品

（1）研磨法。

将一定量的样品放入无菌研钵中充分研磨后再放入装有无菌稀释液的瓶中，盖紧后充分摇匀。

（2）剪碎法。

将一定量的样品剪碎后放入装有无菌水的和玻璃珠的容器中，加盖后用力快速振摇50次，振幅不小于40cm。

（3）捣碎均质法。

将一定的检样放入装有无菌稀释液的均质杯中以8　000～10　000r／min均质1～2min，这是大部分样品都采用的处理方法。

（4）整粒振摇法。

直接称取25g整粒样品置于带有225mL稀释液和直径5mm左右玻璃珠的稀释瓶中，盖紧瓶盖，用力快速振摇50次，振幅要大于40cm。

2）液体样品

（1）原包装样品。

在原包装样品开口处用75%酒精棉擦拭消毒，用灭菌剪剪开包装，在剪开部分覆盖上灭菌纱布或浸有消毒液的纱布，直接吸取样品25mL，或倾入另一灭菌容器中再取样25mL检验。

（2）含有二氧化碳的液体样品。

用灭菌开瓶器将瓶盖启开，用点燃的酒精棉擦拭瓶口，然后将含有二氧化碳气体的样品倒入500mL磨口瓶内，口勿盖紧，覆盖一灭菌纱布，轻轻摇荡，待气体全部逸出后，取样25mL检验。

3）罐头

（1）密闭试验。

将被检罐头置于（86±1）℃水浴中，让罐头沉入水面以下5cm，然后观察5min，若发现有小气泡连续上升，则表明漏气。对玻璃罐头进行试验时，应先浸入温水中，然后放入上述温度的水中，以免骤然爆裂。

（2）膨胀试验。

对于新鲜罐头，一般在（36±1）℃环境中放置7天左右，而水果与蔬菜罐头则在20～25℃环境中放置7天，然后观察罐头盖顶和底部有无膨胀现象。

（3）取样待检。

待检罐头均须冷却至室温，经膨胀试验发生胖听的罐头应先放冰箱使之冷却。开罐前应先将待检罐头编号以便于记录，要在无菌环境中进行。

对于胖听的罐头，可用含4%碘的70%酒精消毒，并用灭菌毛巾擦干，不能用点燃的酒精棉球烧灼，以防内部气体受热而使罐听膨胀加剧，以致出现裂隙，造成内容物喷出。用灭菌的开罐器穿刺罐顶，可设法收集一些罐内气体，然后通过化学方法鉴定气体性质，检验其是否为二氧化碳、氢气或其他气体。之后再无菌采取罐头中心部位的样品，取样量应充足以备复检之用。

对于外观正常的罐头，可用酒精棉球擦去开启端可能存在的污垢和油渍，再用清洁的毛巾擦干，然后用火焰烧灼开启端直至所附水分全部蒸发。用灭菌的开罐器穿刺罐顶，无菌采取罐头中心部位的样品，取样量应充足以备复检之用。

3．检验

采样后，样品应及时送达到微生物检验室，一般不超过3h，尽量减少样品存放的时间。送检过程中，尽可能保持样品原有的微生物性状，易变质的样品需冷藏，同时要防止反复将样品冷冻和溶解，且送检的样品中不得加入防腐剂。微生物检验室接到送检样品后，应立即登记，填写实验序号，并按检验要求立即将样品放在冰箱或冰盒中，积极准备条件进行检验。

食品卫生细菌学检验包括：细菌总数、大肠菌群和致病菌检测。

1）细菌总数测定

细菌总数指食品检样经处理，在一定条件下（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等）培养后，所得1g或1mL食品检样（对包装材料、设备和工具采用1cm²的表面积）中所含细菌菌落的总数，单位记为CFU／g（CFU／mL）。由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落数就是待测样品所含的活菌数。

平板菌落计数法是最常用的活菌计数方法。细菌菌落总数的测定常采用倾注法，测定的准确性与操作有很大的关系，若操作不慎，容易造成人为的误差，如：样品在稀释过程中的误差；倾倒培养基时由于温度过高，致使不耐热的微生物死亡；菌落计数和报告方式造成的误差等。

（1）固体和半固体样品的处理：称取25g样品置于装有225mL生理盐水的锥形瓶中，放于恒温振荡器中振荡20～30min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1～2min，制成1∶10的样液。

（2）液体样品的处理：以无菌吸管吸取25mL样液放于225mL生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分振荡摇匀，制成1∶10的样液。

（3）用1mL无菌吸管吸取1∶10样液1mL，无菌操作放于装有9mL无菌生理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支无菌吸管反复鼓吹使其混合均匀，制成1∶100的样液。重复此操作，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1mL无菌吸管。

（4）根据对样品污染状况的估计，选择连续的3个适宜稀释度的样液（液体样品可包括原液），各吸取1mL于无菌培养皿内，每个稀释度做两个培养皿。同时，分别吸取1 mL空白稀释液加入两个无菌培养皿内作空白对照。

（5）将加热融化并冷却至45℃左右的平板计数琼脂培养基（可放置于45℃恒温水浴锅中保温）倾注培养皿，并转动培养皿使其混合均匀。

（6）待琼脂凝固后，将平板翻转，倒置于恒温培养箱内，37℃培养24～48h。

（7）菌落计数可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数。

选取菌落数在30～300之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于30的平板记录具体菌落数，大于300的记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时不宜采用，应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，可计算半个平板后乘以2，即代表该稀释度下的菌落数。

（8）菌落总数的计算方法。

若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，则计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为1g（mL）样品中菌落总数。若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式（2－1）计算：

式中：N——样品中菌落数；

∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和；

n₁——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数；

n₂——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数；

d——稀释因子（第一稀释度）。

若所有稀释度的平板上菌落数均大于300，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算；若所有稀释度的平板菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算；若所有稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算；若所有稀释度的平板菌落数均不在30～300之间，其中一部分小于30或大于300时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

2）大肠菌群最近似数测定

大肠菌群指一群在37℃生长时能发酵乳糖，在24h内产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，因此，可作为食品是否被粪便污染的指标来评价食品的卫生质量，具有广泛的卫生学意义，据此可推断食品中污染肠道致病菌存在可能性的大小。大肠菌群主要是由肠杆菌科中埃希氏菌属、枸橼酸杆菌属、克雷伯氏菌属及肠杆菌属的一些细菌所组成。食品中大肠菌群是以每100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）来表示的。它是按照一定方案检验后的统计数值，是基于泊松分布的一种间接计数方法。

（1）发酵试验。

固体样品和液体样品的处理及稀释度的制备同细菌总数测定。

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1mL，则用双料LST肉汤），（36±1）℃下培养24h，观察试管内是否有气泡产生，24h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48h，产气者再进行复发酵试验，未产气者为大肠菌群阴性。

（2）复发酵试验。

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36℃培养48h，观察产气情况。产气者报告为大肠菌群阳性管。

（3）大肠菌群最可能数报告。

根据确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表，报告每100g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

3）常见致病菌检验

致病菌指肠道致病菌、致病性球菌等。致病菌的种类很多，食品中致病菌的检验主要包括食品原料及食品中各种病原菌的检验，如致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、沙门氏菌、志贺氏菌、副溶血性弧菌、肉毒梭菌及毒素等。而实际检测中，污染食品的致病菌不是很多，检测的方法也存在一定的局限性，所以很难将所有的致病菌逐一进行检验。因此，一般根据不同食品的特点，选定较有代表性的致病菌作为检测的重点，并以此来判断食品中有无致病菌的存在，如蛋粉中将沙门氏菌作为致病菌检测的对象，酸奶中将致病性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作为致病菌检测的对象。

食品中致病菌检验通常是采用具有选择性作用的培养基对样品进行增菌培养（若样品受致病菌污染严重，则可以不经增菌培养），然后对培养液进行分离培养，根据分离培养后的菌落生长情况、菌体形态和生化特性进行初步推断，最后经微生物的生理生化试验、血清凝集试验及动物试验等，根据微生物的形态特征、生理生化特性、抗原特性动物试验结果等判定样品是否被致病菌污染，并对致病菌微生物进行定性和定量分析。以下主要介绍最常见的致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的检验技术。

（1）检验大肠杆菌。

大肠杆菌的检测一般采用伊红美蓝（EMB）选择性分离鉴别方法。

增菌：以无菌操作取检样25g（mL），放入225mL营养肉汤中，均质1min或用研钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种于乳糖胆盐发酵管内，以测定大肠菌群MPN，其余移入500mL广口瓶内，于（36±1）℃培养6h。无菌操作挑取1环，接种于30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。

分离：将阳性的乳糖胆盐发酵管内样液和增菌液分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上；污染严重的检样，可将检样液直接划线接种于伊红美蓝平板上，于（36±1）℃培养18～24h，观察菌落。

生化实验：自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种到三糖铁（TSI）琼脂或克氏双糖铁（KI）琼脂。同时分别接种蛋白胨水、半固体、尿素（pH　7．2）、琼脂、氰化钾肉汤和赖氨酸脱羧酶试验培养基，均在36℃培养过夜。

结果：TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，氰化钾阴性和尿素阴性的培养物为大肠杆菌。TSI底层不产酸，或H2S、氰化钾、尿素有任一项为阳性的培养物，均不是大肠杆菌。必要时可做氧化酶试验和革兰氏染色镜检。

为进一步验证结果，还可进行血清学试验或肠毒素试验。

（2）检验金黄色葡萄球菌。

国家标准中，金黄色葡萄球菌的检测方法是直接计数法和增菌培养法。直接计数法属于定量检测方法，适用于检查金黄色葡萄球菌数不小于10个／g（个／mL）的食品；而增菌培养法属于定性检测方法，适用于检查受损伤的含有金黄色葡萄球菌的加工食品。

①直接计数方法。

检样处理：以无菌操作取检样25g（mL），放入225mL灭菌生理盐水中，恒温振荡20～30min，配制成1∶10的混悬液，再进行10倍次递稀释。

加样培养：选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入三块Baird－Parker平板，每个平板接种量依次为0．3mL、0．3mL、0．4mL，然后用灭菌涂布棒涂满整个平板。于（36±1）℃培养箱内倒置培养。

接种、检验：在上述三个平板上观察周围有浑浊带的黑色菌落，从中任选5个菌落，分别接种于血平板，（36±1）℃培养24h。然后进行染色镜检和血浆凝固酶试验。

菌落计数：将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌的黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数，除以5再乘以稀释倍数，即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。

②增菌培养法。

检样处理：同直接计数法。

增菌及分离培养：吸取5mL混悬液，接种于装有50mL　7．5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基内，（36±1）℃培养24h，转接种血平板和Baird－Parker平板，（36±1）℃培养24h。挑取血平板上金黄色（少量有白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。镜检后该菌应为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽孢，无荚膜。培养特性为在肉汤中呈浑浊生长；血平板上菌落呈金黄色，少量有白色，大而突起，不透明，表面光滑，周围有溶血圈；在Baird－Parker平板上为圆形、光滑突起，湿润，颜色呈灰色到黑色，周围有一浑浊带，在其外层有一透明圈。

凝固酶试验：吸取1∶4新鲜兔血浆0．5mL，放入小试管中，再加入培养24h后的金黄色葡萄球菌肉汤培养物0．5mL，振荡摇匀，置于（36±1）℃恒温箱或水浴锅内，每半小时观察一次，连续观察6h，若出现凝固，即将试管倾斜或倒置，此时呈现凝块者，可认为是阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤做对照。

结果若可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5mL脑心浸液肉汤（BHI），（36±1）℃培养18～48h，重复试验。

（3）检验沙门氏菌。

沙门氏菌属是肠道杆菌科中最重要的病原菌属，为革兰氏阴性短杆菌，无芽孢，无荚膜，兼性厌氧，最适生长温度为37℃。沙门氏菌在普通显微镜下和普通培养基中不能与大肠杆菌进行区分，但沙门氏菌不发酵乳糖及蔗糖，不液化吲哚，在肠道菌鉴别培养基上会形成无色透明菌落，从而可以与大肠杆菌区别开来。对沙门氏菌的检验方法一般包括五个步骤：前增菌，用无选择性的培养使处于濒死状态的沙门氏菌恢复活力；选择性增菌，使沙门氏菌得以增殖，而大多数其他细菌受到抑制；选择性平板分离；生化试验和血清学分型鉴定。

前增菌和选择性增菌：无菌操作取样25g（mL），加在装有225mL缓冲蛋白胨水的广口瓶内，于（36±1）℃培养4h（干蛋品培养18～24h），移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18～24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内，于（36±1）℃培养18～24h。

选择性平板分离：取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸铋琼脂平板和一个胆盐硫乳（DHL）琼脂平板（或HE琼脂平板、WS琼脂平板、SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于（36±1）℃分别培养18～24h，观察各个平板上生长的菌落情况。

生化试验：自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在接种三糖铁的同时，再接种蛋白胨水（用做吲哚试验）、尿素琼脂（pH　7．2）、氰化钾培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管，于（36±1）℃培养18～24h，必要时可延长至48h。

血清学分型鉴定：

①抗原的准备。一般采用1．5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2．5%～3%）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O血清凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。若H抗原发育不良，将菌株接种在0．7%～0．8%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0．3%～0．4%半固体琼脂的小玻璃管1～2次，自远端取菌培养后再检查。

②O抗原的鉴定。用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株，不能分型。

③H抗原的鉴定。不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝聚，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的，或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。

菌型的判定和结果报告：综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照沙门氏菌属抗原结构表判定菌型，并报告结果。