黑曲霉的鉴定

任务2　黑曲霉的鉴定

一、相关知识

在光学显微镜下，黑曲霉菌丝有隔。孢子头呈椭圆形，孢子着生在分生孢子梗上，小梗单层或双层，孢子与孢子间由小梗连接，形成孢子链。分生孢子链生于小梗顶端，呈辐射状排列或丛集成柱形。孢子直径2．5～4．0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，呈黑褐色。

黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝为白色，之后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色，顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子（图3－29）。

图3－29　黑曲霉的形态

黑曲霉在生长过程中消耗淀粉察氏培养基中的淀粉，向培养基中滴入I₂－KI试剂后，菌落周围的淀粉因被黑曲霉分解而不显蓝色，而培养基的其他部分因含有淀粉，与I₂－KI试剂反应变蓝，菌落周围会形成一个透明圈。透明圈越大，表示菌株代谢越旺盛。

黑曲霉在pH　2．0～2．5时有利于合成柠檬酸，在pH　2．5～6．5范围内以菌体生长为主，最适生长pH为5．0～6．0。利用黑曲霉在pH　2．0～2．5的培养基中产生柠檬酸对其进行鉴定。发酵产物中柠檬酸能与CaCO₃形成沉淀，利用钙盐法即可检测。

二、实训器材

1．材料

分离纯化的黑曲霉菌种。

2．器具及其他用品

微生物实验常用器材，载玻片，显微镜，直尺，振荡器等。

3．试剂

FeSO₄·7H2O，NaNO₃，K₂HPO₄，KCl，MgSO₄·7H2O，CaCO₃，1mol／L氢氧化钠溶液，1mol／L盐酸，淀粉，蔗糖，琼脂，75%乙醇，马铃薯，纯净水。

0．5%酚酞指示剂：0．5g酚酞，溶于100mL　95%乙醇中。

I₂－KI试剂：碘化钾3g，纯净水100mL，碘1g，先将碘化钾溶于纯净水中，待全部溶解后再加碘，振荡溶解，保存在棕色玻璃瓶内。

三、实训步骤

1．形态观察

挑取菌苔少许，涂在载玻片上，在显微镜下观察，结合菌落形态特征综合分析。观察时最好摘下眼镜，因显微镜具有聚焦校正功能。若确需佩戴眼镜，应防止眼镜镜片与目镜镜片接触，以免造成镜片划痕。

显微镜照明亮度可通过升降聚光器或改变光源亮度进行调节，一般情况下聚光器都是调到最高位置。只要能获得良好的观察效果，也可以灵活运用对虹彩光圈、聚光器高度、照明光源强度的协同调节。

使用粗准焦螺旋聚焦物像时，先从侧面注视并小心调节低倍物镜靠近载玻片，然后用目镜观察，慢慢调节物镜离开载玻片。对在低倍镜下看到的物像，可以转动物镜转换器将其他物镜转到工作位置，然后用细准焦螺旋对物像进行清晰聚焦，可避免因使用粗准焦螺旋时可能发生的误操作而损害镜头或玻片。

2．淀粉分解实验

淀粉分解实验用2%淀粉察氏培养基进行。在察氏培养基中添加2%的淀粉，配制、灭菌及平板制作方法同无菌察氏培养基的制作。

用接种环刮取纯化的黑曲霉孢子一环于装有100mL无菌水和玻璃珠的锥形瓶中，振荡。取1mL孢子悬液注入2%淀粉察氏培养基平板中涂布，37℃倒置培养2天，向培养基中滴入I₂－KI试剂，用直尺测量菌落产生的透明圈大小并记录。

3．产柠檬酸鉴定

鉴定疑似黑曲霉能否产柠檬酸用pH　2．5的PDA培养基（表3－14）。

表3－14　PDA培养基成分表

取一支装有疑似黑曲霉菌种的试管，在酒精灯火焰上方无菌操作倒入蒸馏水，用无菌接种环轻轻刮下培养基斜面上的菌丝及孢子，倒入装有培养基的锥形瓶中，摇匀。置于振荡器中，35℃200r／min培养2天。

取5mL发酵液于试管中，滴入饱和CaCO₃溶液，有白色沉淀则证明产生柠檬酸，从而确定疑似黑曲霉为黑曲霉。

4．产酸量测定

取10mL发酵液，滴加0．5%酚酞指示剂2滴，用0．1mol／L　NaOH溶液滴定至淡粉红色，计算产酸量。选择产酸量大的菌株进行后续实验。

5．试管斜面扩大培养

确定了所分离的菌种为产酸高的黑曲霉后，需要对此菌株进行扩大培养以备后用。所用培养基为PDA培养基，做成试管斜面备用。

将长好的菌种试管与待接种的PDA培养基试管依次排列，夹于左手的掌心、拇指与其他四指之间，用右手的无名指、小指和手掌边夹住棉塞并拔出，将试管口于酒精灯火焰附近灼烧。将接种环垂直插入酒精灯火焰中烧红，再横过火焰3次，然后放入菌种试管中，在管壁上停留片刻待其冷却。取少许菌种置于新鲜PDA斜面培养基中，按蛇形线接种，取出接种环，将试管口和棉塞进行火焰灭菌，重新塞好。烧死接种环上的残余菌，将接种环放回搁架。在试管口处写明菌种名称、日期。置培养箱中32℃恒温培养。用于保藏的菌种需要培养3～4天，一部分出现成熟的颜色即可放入4℃冰箱保藏。直接使用的菌种需要培养5～6天至全部成熟，但不宜培养过度。