综合实验九 红曲色素发酵技术
一、背景知识
（一）红曲霉的应用历史
红曲是用红曲霉属真菌接种于大米上经发酵制备而成，在我国古代称为丹曲，是中华民族的一大发明。其主要用于红酒酿造、发酵食品、色素及中药等方面。利用微生物生产色素和医药，这在世界微生物学史上有着重要意义。红曲的应用已有近两千年的历史，早在汉魏时期就已问世，如汉代王粲所著《七释》中提到，“瓜州红曲，参糅相半，软滑膏润，入口流散。”说明红曲在当时已经得到广泛的应用。随着实践经验的积累，红曲的应用就更加广泛了。元代以后，红曲在医药上的应用就有较多的论述。如在性味方面，《饮膳正要》曰“味甘，平，无毒”；《本草纲目》曰“甘，温，无毒”；《本草逢源》曰“甘味，苦辛，平”，等等。在归经方面，《本草经解》曰“入足蒴阳肝经，足太阳脾经”。在功用主治方面，《本草纲目》曰“治女人血气痛及产后恶血不尽，擂酒饮之良”；《医林篡要》曰“解生冷物毒”，等等。但红曲霉真正的理论研究还是从20世纪70年代开始的，Monacolim K等发现的红曲霉代谢产生的次级代谢产物使红曲霉成为研究热点。此外，随着现代生物科学技术的发展，各学科的交叉融合，在红曲霉的生物学特性、菌种选育、代谢产物生理功能、酶学性质、生产机械化、红曲产品等方面都进行了广泛的研究，并取得重大突破。
（二）红曲霉生物学特性
1.红曲霉的形态及分类
红曲霉形态为不规则的分支菌丝，菌丝具有大型液泡及线粒体。有隔，多核，含橙红色颗粒，分生孢子单一或成串生长于菌丝顶端，属内生型分生孢子，并从上至下逐渐成熟。中国台湾东吴大学黄显宗教授认为，有性生殖时，细胞核的交换可能通过并排菌丝间沟通，或通过产精器透过受精丝进行，产囊体受精后膨大发育为产囊丝，不育菌丝自闭囊果柄的顶端长出将之包裹，产囊体中心内的细胞壁物质皆消化掉而形成圆形或不定型的产囊丝串和细胞。
刘波（1978）、戴芳澜（1987）均采用了Martin分类系统，将红曲霉归于真菌门（The Fungi）子囊菌纲（Ascomycetes）真子囊菌亚纲（Euascomycetes），曲霉目即散囊菌目（Eurotiales），曲霉科即散囊菌科（Eurotiaceae）；而俞大绂（1985）、张纪忠（1990）等采用了Ainsworth分类系统，这也是目前多数真菌学者趋向参照的分类系统，将红曲霉归属于真菌界（The Fungi）真菌门（Eumycota），子囊菌亚门（Ascomycotine）不整子囊菌纲（Plectomyhcetes）散囊菌目（Eurtotiales）红曲科（Monascaceae）。在此，于散囊菌目下建立红曲科，从而与散囊菌科分开，红曲科下仅有一属即为红曲霉属。
2.红曲霉的培养特性
红曲霉是腐生真菌，通常出现在乳酸自然发酵的基质中。大曲、制曲作坊、酿酒醪、青贮饲料、泡菜、淀粉厂等都是适于它们繁殖的场所。红曲霉生长最适温度为27～33℃，最适生长pH 3.5～5.0，可耐pH 2.5，尤嗜乳酸。能耐10%的乙醇，能以糖类、有机酸、醇类为碳源，能利用硝态氮、氨态氮和有机氮，能合成多种维生素，可在无维生素的合成培养基中生长。培养红曲霉菌株多用麦芽汁琼脂培养基，红曲霉在此培养基上生长良好，菌丝初期为白色，成熟后变为淡红色、紫红色、橙红色、烟灰色等，因种而异。菌落的结构呈绒毛状或呈皮膜状。呈皮膜状的菌落少褶皱或具有辐射纹。红曲霉能产生红色素，常将色素分泌到培养基中，使培养基呈现红色。
（三）红曲霉的主要初级代谢产物
1.酶
红曲霉能产生多种酶类，主要有淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糊精化酶、麦芽糖酶、蛋白酶、羧肽酶、果胶酶等，其中红曲霉葡萄糖淀粉酶有五种类型，主要成分为E3和E4，不同种类的红曲霉菌株产酶的种类及产量有所差异，某些红曲霉菌株还能分泌直接催化己酸和乙醇合成己酸的胞外酶。吴衍庸教授认为，浓香型白酒的发酵过程中酯化酶对香味物质（芳香酯类）的形成起着重要的作用。我国很多地区（浙江、江苏、江西、福建等）及世界一些国家（日本及一些东南亚国家等）利用红曲酿制黄酒。此外，红曲还可以被用来酿制食醋、酱油、腐乳等。这些都是对红曲产生的酶类的应用的具体表现。
2.脂肪酸
1909年，日本学者的研究表明红曲霉培养物主要含有的脂肪酸是C18∶1、C18∶2、C16∶2、C16∶0、C18∶0、C16∶1等，认为不同红曲霉菌株产生的脂肪酸成分有很高的相似性。气相色谱分析结果表明不饱和脂肪酸含量达64%～77%，多烯不饱和脂肪酸含量达16%～27%，经过活性测定认为，它们可能有增强Monacolins分解甘油三酯、降低极低密度脂蛋白胆固醇的功能。
3.有机酸
泰国研究者对收集到的40株红曲霉菌株进行了筛选。发现Monascusaraneousus AHU9087菌株在含有10%葡萄糖、0.025%牛肉膏提取物的培养基中L-苹果酸产量达到28.1g/L，随后又对菌株进行诱变处理，分离得到的白化突变株，其L-苹果酸最大产量可达48.7g/L。
（四）红曲霉主要次级代谢产物
1.红曲色素
红曲色素是红曲霉在生长代谢过程中产生的多种色素的混合物，1959年至1963年间，研究弄清并确定红曲色素的结构式共有6种。但此后的20年间，对红曲色素的结构及其性质研究方面的进展不大，也未有新的色素发现。1993年郭东川等人从红曲霉AS3.4617菌体中分离得到新结构的色素，经分析其分子式可能为C23H27O5N和C25H31O5N，该分子的核磁共振与红曲玉红素（Monascorubin）相似。1998年有研究证明，红曲色素是红曲霉的一种能量贮存物质，又是一种氮源捕获剂。在这些红曲色素中以红斑素和红曲红素为主要成分。
红曲色素是一种安全性极高的天然色素，可通过多种方法提高其水溶性，并且稳定性好，且已证明不含黄曲霉毒素，经急性毒性试验、亚急性毒性试验、慢性毒性试验以及致突变性试验都无毒性，也无致突变作用，故可广泛应用于食品、化妆品、医药、化工等工业。
2.Monacolin类物质
1979年，日本远藤章教授从红曲霉属（Monascus）发现了能强力抑制胆固醇合成的活性物质，命名为Monacolin K。1985年又从红色红曲霉（M.ruber）中分离出与Monaclin K结构相似的其他活性成分，分别命名为Monaclin L、Monacolin X、Monacolin J、Dihydromonacolin L和Dihydromevindin等，其中以Monacolin K活力最高，现已制成商品出售。1986年，远藤章教授又发现了Monacolin M。目前已从红曲霉属中分离检出8种Monacolin类物质。
3.麦角固醇
麦角固醇是人体必需维生素D的前体物质之一，经紫外线照射后即转化为维生素D。维生素D是一种重要的药品，能防治婴幼儿佝偻病，促进孕妇和老年人钙磷的吸收。普通食品中维生素D的含量有限。因此，需要适当补充，目前国内外麦角固醇的生产仅限于酵母菌。红曲霉属（Monascus）中的许多菌株都能不同程度地产生麦角固醇。所产生的麦角固醇主要存在于菌体内，可采用碱性甲醇回流皂化，然后用乙醚振荡抽提。麦角固醇量与色素生成量成正比，且有的红曲霉菌株麦角固醇产生量高达2%以上。因此，在食品中添加红曲，对人类防治维生素D缺乏症将有重要意义。
4.橘霉素
橘霉素是一种真菌毒素，具有肾毒性，也称为肾毒素。毒性比较明显，可引起实验动物的肾脏肿大、尿量增多、肾小管扩张和上皮细胞变性坏死等症状。橘霉素同时有致畸性，据Ciegler等人的研究报告显示，在给发育4d的鸡胚胎注射橘霉素后，胚胎的脚发生了变形。橘霉素含有一个羧基，其分子式为C13H14O5，分子量250，在无水乙醇或苯-环己烷中结晶，呈柠檬黄针状结晶。橘霉素的生成与否与菌种、培养方式等方面有关，并非所有的红曲霉菌株都会产生橘霉素，例如日本用从毛红曲霉、红色红曲霉、淡色红曲霉可以生产出不含橘霉素的红曲产品。因此控制橘霉素可以从菌种、培养条件、方式等几个方面入手。首先应当筛选不产橘霉素或橘霉素生成量很低的菌种用于生产，其次是通过发酵工艺的改良减少橘霉素的生成，其中筛选不产或低产橘霉素的菌种更为重要。
二、实验简介
本实验主要由两部分组成，第一部分为红曲色素高产菌株的原生质体育种，第二部分为红曲色素的固态发酵生产技术。涉及红曲色素生产的上、中、下游完整实验路线。综合了原生质体制备、菌种选育、固态发酵及红曲色素提取与制备等过程。通过这两部分内容的学习和实践，可为今后从事相关产品的工业生产奠定理论和实践基础。
实验9-1 红曲色素高产菌株原生质体育种
（一）实验目的
学习和了解红曲霉原生质体制备的原理，理解影响原生质体形成的因素及同工酶技术在菌株鉴定上的应用，掌握原生质体制备、育种及计数的方法。
（二）实验原理
原生质体是指微生物细胞在一定酶的作用下，脱去细胞壁后所剩下的那部分结构，由于原生质体失去细胞壁的保护而成球形，只能在高渗透压的环境中存活，并在合适的培养基中恢复细胞壁而再生，对环境、诱变剂等更为敏感，因此利用原生质体作为诱变材料，诱变效果较传统方法更为理想，此外，原生质体也是细胞杂交、基因工程等育种方法的材料。
产量高、质量好、活性强是原生质体育种成功的基础。影响原生质体产量和质量的因素很多，主要是基因型、菌龄、酶的种类与组合、酶液的浓度、酶液的pH值、酶解温度、菌体培养的方式、菌体细胞预处理方法、分离与纯化方法等。
要制备红曲霉的原生质体，先要培养出红曲霉的菌丝体，培养菌丝体的方式主要有两种。一种是通过液体振荡培养的方式得到；另一种采用玻璃纸平板培养。玻璃纸具有半透膜的性质，菌丝的直径比玻璃纸的孔隙大，不能透过玻璃纸进到培养基中，而培养基中的水分及营养物质可以透过玻璃纸提供菌体细胞的营养。通过玻璃纸平板培养可以得到纯净的菌丝体，且菌丝处理过程中不需经过洗涤、离心等步骤。减少实验的工作量及染菌的概率，是较为常用的方法。
红曲色素产量的提高离不开优良菌种的选育，菌种选育技术的进步是发酵工业发展的重要依托。紫外诱变过程较为简单，是一种最常用、最有效的诱变方法，由于它诱变频率高且不易发生回复突变，因此一直受到众多微生物工作者的青睐。目前工业上生产的高产菌株几乎都经过紫外诱变的育种过程。
（三）实验材料
1.菌种
紫红曲霉（Monascuspurpureus）CICC40710，中国食品发酵工业研究院。
2.主要设备
三角瓶、恒温培养箱、摇床、灭菌设备、显微镜、超净工作台、血球计数板、恒温水浴锅、注射器、细菌过滤器、电子分析天平、紫外灯、分光光度计、旋涡振荡器、电泳设备、离心机。
3.主要试剂
酵母膏、琼脂、麦芽浸粉、蛋白胨、蜗牛酶、纤维素酶、硫酸镁、硝酸钠、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、黄豆粉、玉米浆干粉。
（1）30%丙烯酰胺（Arc）-0.8%甲叉双丙烯酰胺（Bis）溶液
称取30g Arc和0.8g Bis，用蒸馏水定容至100mL，于棕色瓶中0～4℃低温避光保存。
（2）30%丙烯酰胺（Arc）-2.5%甲叉双丙烯酰胺（Bis）溶液
称取10g Arc和2.5g Bis，用蒸馏水定容至100mL，于棕色瓶中0～4℃低温避光保存。
（3）低离子强度电极缓冲液（pH 8.3）
称取6g Tris和28.8g甘氨酸，加蒸馏水溶解，定容至1000mL，0～4℃低温保存，用时稀释10倍，pH 8.3。
（4）酯酶染色液
50mgα-醋酸荼酯和50mgβ-醋酸荼酯溶解于2mL丙酮-水溶液（1∶1）中，再加100mg坚固兰。用0.1M pH 6.5磷酸盐缓冲液稀释到150mL。
4.培养基及其制备
（1）斜面试管培养基
麦芽浸粉2g，蛋白胨2g，琼脂2g，水100mL，pH值自然。在0.1MPa压力下灭菌20min。
（2）菌丝生长平板培养基
麦芽浸粉2g，蛋白胨2g，琼脂2g，水100mL，pH值自然。在0.1MPa压力下灭菌20min。
（3）原生质体再生培养基
采用双层平板法：麦芽浸粉2g，蛋白胨2g，上层琼脂0.8%，下层琼脂2%。均用0.6M的mgSO4·7H2O配制。
（4）种子培养基
淀粉3.0g，硝酸钠2.5g，磷酸二氢钾2.5g，硫酸镁1.0g，黄豆粉1.0g，玉米浆干粉1.0g，水1000mL，pH 4.3（用乳酸调）。
（5）筛选培养基
葡萄糖40.0g，蛋白胨5.0g，硫酸镁1.0g，硝酸钠3.0g，磷酸二氢钾1.5g，水1000mL，pH 4～4.5（用乳酸调）。
（四）实验方法与步骤
1.实验流程
图1-9-1 实验流程图
2.实验方法与步骤
（1）菌种的活化
在超净工作台上，将冰箱斜面保存菌种用接种环挑取一环斜面孢子移接到新鲜的试管斜面培养基中，在恒温培养箱中，32℃培养5～6d。
（2）菌丝培养
①孢子悬浮液制备
将斜面活化好的菌种用5mL无菌水洗下带有玻璃珠的试管中，振荡，使孢子分散均匀，备用。
②菌丝培养
将玻璃纸剪成略小于平皿的圆形纸片，置于空平皿内，灭菌后备用。将菌丝生长平板培养基灭菌冷却后倒平皿，每平皿约装培养基30mL。培养基凝固后，将无菌的玻璃纸在超净工作台，无菌的加入已凝固的平皿内，用无菌的涂布棒摊平玻璃纸。取0.3mL的红曲霉孢子悬液，加入玻璃纸上，用无菌的涂布棒涂布均匀。置于32℃的恒温培养箱内培养48～72d，至菌丝长出。
（3）菌丝收集
在超净工作台上，无菌条件下，从玻璃纸平板上用无菌镊子取出菌丝0.6g置于灭过菌的试管中。
（4）原生质体制备
在装有收集的菌丝的试管中，加入6mL由0.6M硫酸镁渗稳液配制并经灭菌后的微孔滤膜（0.2μm）过滤除菌的混合酶溶液（蜗牛酶∶纤维素酶＝7∶3），置于32℃下恒温酶解2～3h，定时振荡，使菌体悬浮，充分酶解，每隔0.5h计算原生质体形成数一次，酶解完成后，终止水浴，计算原生质体形成数。
原生质体形成数计算方法：用无菌吸管，小心地向菌丝酶解液吹吸几次，促使原生质体从残余菌丝上释放。取洁净的血球计数板，将盖玻片放在计数室上，吸取少量酶解液于盖玻片边缘，使其自行渗入（多余菌液用滤纸吸去），静止5min后，将血球计数板放在载物台上，低倍镜下找计数室，于高倍镜下找到清晰的计数室线条。如果血球计数板为25中方格，则取5个中方格中的原生质体数（即取4角4个中方格和中央1个中方格的原生质体数）；如为16中方格，则取4个中方格中的原生质体数（即取4角4个中方格的原生质体数）。
计算公式为：
①25中方格计数公式
1mL菌液中的原生质体数＝（5个中方格的原生质体总数÷5）×25×10×1000×稀释倍数
②16中方格计数公式
1mL菌液中的原生质体数＝（5个中方格的原生质体总数÷5）×16×10×1000×稀释倍数
（5）原生质体释放形态观察
取少量的洗涤过的菌丝，放入凹玻片中央，加入少量混合酶液，置于32℃温箱中酶解，定时取出观察。
（6）原生质体收集
在无菌操作的条件下，用灭菌过的四层擦镜纸过滤除去残存的菌丝碎片，滤液离心，洗涤后弃去上清液，沉淀悬液于2mL的渗透压稳定剂。即得纯化的原生质体。
（7）原生质体紫外诱变
将纯化的原生质体用高渗液稀释至106个/mL，备用。紫外灯（266nm，15W）预照1h，取6mL的原生质体悬液注入直径为6cm的小培养皿中（内含无菌搅拌子），置于磁力搅拌器上，距离为20cm，搅拌照射2～5min，致死率达90%以上，在红灯下，用高渗溶液梯度稀释后，取0.1mL加于表面干燥的再生培养基平板上，随后加入上层培养基，迅速摊均匀。用黑布或报纸包裹培养皿，32℃培养4～5d。
（8）高产突变菌株的筛选
待再生平板长出单菌落后，挑取菌落较大、颜色较深的单菌落（不少于50株）接入斜面保存，温度32℃，培养7d，至斜面长满孢子。用接种铲挖取一铲，接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，32℃、200r/min振荡培养42h。按照5%的接种量转接至装有50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，至少3个平行，33℃、200r/min发酵48h，测定发酵液红曲色素的色价，筛选出红曲色素产量有较大增加的突变菌株。
色价测定：采用紫外分光光度计法吸取发酵液1mL，加入装有9mL70%乙醇溶液（pH 6.0～7.0）的试管中，加塞，摇匀，静置15～20min后，用快速滤纸过滤得清液，再适当稀释，70%乙醇溶液做空白对照，用1cm比色皿在505nm吸收波长处测定吸光度值。吸光度值乘以发酵液的稀释倍数，即得发酵液的色价（U/mL）。
发酵液色价（U/mL）＝ODλ×稀释倍数
（9）突变菌株酯酶同工酶谱分析
①酯酶液的制备
将红曲霉原菌株及与筛选的突变株在麦芽汁斜面上活化后，32℃斜面培养5d，制成孢子悬液（107个/mL）接种麦芽汁培养液，30℃摇床培养7d，抽滤收集菌丝，用蒸馏水及0.05MTris-HCl缓冲液（pH7.8）分别洗涤后离心，取300mg菌体-20℃冷冻24h备用，加1.5mL样品缓冲液（0.012mol/L，Tris-Citric Acid）pH 8.3用时加0.5g蔗糖，再加100mg石英砂，冰浴研磨15min，15000r/min、4℃离心20min，取上清液直接用于电泳。
②聚丙烯酰胺凝胶电泳
微量进样器吸取25μL样品溶液，慢慢滴入试样槽底部，再小心加入30μL40%蔗糖溶液，然后沿试样槽顶加入几滴0.25%溴酚蓝做指示剂。电泳槽置于冰箱中（0～4℃），接通电源开始电泳。开始时稳压150V，待溴酚蓝进入分离胶后升至200V。整个电泳过程中电压保持恒定。当指示剂移至距离凝胶下端1cm左右停止电泳。小心取出凝胶用蒸馏水冲洗后，置于酯酶染色液中40～60min，直至区带显出。漂洗干净，保存于蒸馏水中。
（五）实验结果与分析
1.比较不同酶解时间原生质体形成数的大小，并以时间为横坐标，原生质体形成数为纵坐标作图，说明不同时间原生质体形成数变化趋势。
表1-9-1 不同酶解时间原生质体形成数
2.比较原生质体与分生孢子的形态差异。
表1-9-2 原生质体与分生孢子的形态差异比较
3.描述原生质体释放过程。
4.在平板中挑出的突变菌株红曲色素发酵产量。
5.分析出发菌株与突变株酯酶同工酶谱之间的差异。
（六）实验注意事项
1.原生质体从菌丝中释放出来的部位主要是菌丝体的尖端，小部分是从菌丝的侧面。因此，在制备原生质体时，尖端菌丝越多越有利于原生质体的制备，在菌丝的材料选择上，应选用幼龄的菌丝。
2.紫外诱变必须在超净台中进行，因为在其他地方难以保证洁净和密闭。紫外线的穿透能力很弱，会被玻璃培养皿的盖子阻挡住一部分，所以诱变的时候应该不要用盖子。紫外线的照射时间不是固定的，照射时间与致死率和突变率有关，一般都是要追求一定的致死率，而这个致死率菌株不同，照射时间也不同。
3.紫外诱变过程中采用红光灯作为光源是为了菌株的光修复，经过紫外诱变之后不能接触日光灯和自然光，所以要在红光灯下涂平板。紫外诱变的时候用紫外灯就行。诱变结束后开红光灯涂平板，完成之后应该避光培养。在紫外诱变的时候要避免接触日光灯和自然光，所以要用帘子来密闭。
4.血球计数板要洗净，切勿磨损计数格，可用较大水流冲洗（均匀刷洗）自行晾干或用吹风机吹干。
5.在原生质体计数时，会有小部分红曲霉的孢子进入血球计数板的小格中，在计算时应会区分原生质体与孢子之间的形态差别。
6.再生培养基平板下层倒好凝固后，应放置32℃的培养箱中过夜，既可以检查平板有无被污染，又可以蒸发培养基表面的水分。若培养基表面有水分，可能会影响到涂布在上面的原生质体的环境，使渗透压降低，导致原生质体破裂。
实验9-2 红曲色素的发酵与制备
（一）实验目的
学习和掌握红曲色素生产工艺，理解在红曲色素发酵、提取、制备工艺中各参数的选择及依据。
（二）实验原理
随着人们生活水平的提高和食品科学技术的发展，食品添加剂在食品加工中的应用越来越普及，作为安全着色剂的红曲色素也越来越受到人们的青睐。红曲色素是红曲霉属在生长代谢过程中产生的天然色素，也是世界上目前仅有的利用微生物生产的食用天然色素。在我国已有一千多年的生产和应用历史，长期以来广泛用作食品着色剂和调味剂等。相对合成色素和其他已知天然色素而言，其具有安全性高、热稳定性强、对蛋白质的染着力好、色调鲜艳、质量稳定和价格低廉等优点。
红曲色素是多种色素成分的混合物。目前已知结构的红曲色素有12种，呈现橙色、黄色、红色三种颜色。其中橙色的主要是红曲玉红素（Monascorubrine）和红斑红曲素（Rubropunctatine）；黄色的主要是安卡红曲黄素（Ankaflavine）和红曲素（Monascine）；红色的主要是红曲玉红胺（Monascorubramine）和红斑红曲胺（Rubropunetamine）。红曲色素按溶解性可分为水溶性和脂溶性色素两类。脂溶性色素可溶于乙醚、氯仿、乙醇、醋酸和正己烷等溶剂。水溶性色素的溶解度与水溶液的pH有关，在中性或碱性条件下极易溶解，而在pH4.0以下的酸性范围内或含5.0%以上盐溶液中，其溶解度呈减弱倾向。与其他天然色素相比，红曲色素对pH较稳定，色调不像其他天然色素那样易随pH的改变而发生显著变化，它的乙醇溶液在pH为11.0时仍保持稳定的红色；红曲色素的热稳定性很好，在120℃加热1.5h，色素的保存率在84%以上，在100℃加热3h可达到同样的保存率。温度每降低20℃，耐热时间可延长一倍；红曲色素也几乎不受食品中常见金属离子及氧化剂和还原剂的影响。但红曲色素对光敏感性较为敏感，易于褪色。光照时间越长，褪色程度越大。在自然光照射下，不到14d，色素的保存率就在50%以下。
目前主要通过传统的固态发酵产品红曲米提取物和深层液态发酵红曲菌提取物红曲红来获得。与液体深层发酵（Submerged Fermentation）相比，固态发酵有其独特的优势，如能耗低，丝状真菌固态发酵过程中不易受到细菌污染，大规模发酵过程往往无须严格的消毒，培养基简单、多为便宜的天然物质，生产过程节水，操作简便易行等。如果发酵后的成熟醅中含水量低，可直接作为产品，提取成本低。特别是采用固态发酵工艺无废水废渣产生，因此不会造成二次污染。从生态学和仿生学的观点，固态发酵法更适宜于大多数丝状真菌的代谢、生长、繁殖过程及生态。
（三）实验材料
1.菌种
紫红曲霉突变株（Monascuspur pureus），前期实验诱变得到。
2.主要设备
三角瓶、恒温培养箱、摇床、灭菌设备、超净工作台、恒温水浴锅、电子分析天平、分光光度计、旋涡振荡器、离心机、循环水式真空泵、真空干燥箱、冷冻干燥机、旋转蒸发仪、粉碎机。
3.主要试剂
酵母膏、琼脂、麦芽浸粉、蛋白胨、硫酸镁、硝酸钠、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、籼米、黄豆粉、玉米浆干粉、无水乙醇、丙酮、盐酸、氢氧化钠等。
4.培养基及其制备
（1）斜面试管培养基
麦芽浸粉2g，蛋白胨2g，琼脂2g，水100mL，pH值自然。在0.1MPa压力下灭菌20min。
（2）种子培养基
淀粉3.0g，硝酸钠2.5g，磷酸二氢钾2.5g，硫酸镁1.0g，黄豆粉1.0g，玉米浆干粉1.0g，水1000mL，pH 4.3（用乳酸调），在0.1MPa压力下灭菌20min。
（3）籼米培养基
籼米常温浸泡，沥干。称150g装入1000mL的三角瓶中，加水50mL，葡萄糖4g，甘油0.4g。在0.1MPa压力下灭菌30min。
（四）实验方法与步骤
1.实验流程
实验流程如图1-9-2。
图1-9-2 红曲色素工艺流程
2.实验方法与步骤
（1）籼米浸水
籼米置于清水中，用乳酸调整pH值3.0～4.0，浸泡12～16h，使籼米吸水，便于蒸煮糊化。
（2）沥干、蒸煮
将籼米用纱布沥干后，称取150g置于1000mL的三角瓶中，加入葡萄糖4g，甘油0.4g，再加入50mL水，搅拌均匀，121℃灭菌30min，趁热打散，冷却备用。
（3）接种
①菌种的活化
在超净工作台上，将冰箱保存红曲霉斜面菌种用接种环挑取一环斜面孢子移接到新鲜的试管斜面培养基中，在恒温培养箱中，32℃培养5-6d。
②种子扩大培养
以10mL无菌水将培养好的斜面上的孢子洗下制成孢子悬液，将并将孢子液接种至装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，32℃、220r/min振荡培养42h。
③接种
在超净工作台中，用无菌移液器按照5%的接种量，将红曲霉液体种子接入盛有冷却至35～40℃的籼米培养基的三角瓶中。
（4）培养、干燥
30℃培养10～12d，记录红曲霉的生长情况及红曲色素的合成情况（色素的合成以培养基中的色价量为参考），当培养基中米粒变红且无白心时，取出，45℃真空烘干得到红曲米。
色价测定：无菌操作条件下，从三角瓶中倒出2～3g的培养基并置45℃真空烘干，根据培养基中的色素合成量适量称取一定量的样品，放入带刻度的100mL具磨口塞试管中，加入70%乙醇至50mL，摇匀后放入60℃水浴保温2h，取出冷却（必要时补充定容），用普通定性滤纸过滤入具塞试管或三角瓶中，约滤出10mL左右即可，吸取滤液1mL放入25mL试管或容量瓶中，加入70%乙醇稀释定容至25mL。用1cm比色皿以70%乙醇作空白，在分光光度计上取波长505nm，测定样品萃取稀释液的吸光度，将测得的样品平均吸光度乘以2500（稀释倍数），即为发酵样品的色价。
（5）红曲色素提取
将烘干的红曲米用粉碎机粉碎，过筛40目筛，称取25g红曲米粉末加入1000mL的烧瓶中，再在烧瓶中加入500mL浓度为75%的乙醇（料液比为1∶20），调整pH值为8.0，接上冷凝管，控制提取温度为40℃，回流提取3h后，用滤纸抽滤除去红曲米渣。
（6）红曲色素样品制备
将红曲色素提取液用旋转蒸发仪进行浓缩，浓缩液用冻干机冻干后，得到红曲色素成品。
（7）红曲色素样品色价分析
称取0.01g红曲色素制品用70%乙醇定容至50mL，再适当稀释，70%乙醇溶液做空白对照，用1cm比色皿在505nm吸收波长处测定吸光度值。使吸光度值在0.2～0.8，吸光度值乘以稀释倍数，即得红曲色素样品的色价（U/mL）。
（五）实验结果与分析
1.红曲霉固态发酵过程中，菌体生长情况观察及色素合成测定结果。
表1-9-3 菌体生长情况观察及色素合成测定结果
2.计算红曲色素提取率。
提取率＝成品红曲色素质量（g）/红曲米原料质量（g）×100%
3.红曲色素样品中的色价分析
（六）实验注意事项
1.红曲色素主要通过固态发酵和液态发酵两种方式进行生产。在固体发酵中，首先生产红曲米，然后再从红曲米中提取色素，根据我国的食品添加剂标准，红曲米也可以作为色素直接使用。
2.红曲色素是红曲菌代谢过程中产生的一系列聚酮化合物的混合物，组成较复杂。使用不同的红曲菌株、培养基、发酵条件所产生的红曲色素组成有较大差异，因为其生成途径也有不同。
3.近年来由于红曲色素中有真菌毒素橘霉素的发现，其安全性也受到了广泛的重视。日本已在红曲色素标准中规定了橘霉素的限量要求，我国的国家标准与行业标准尚未涉及。橘霉素的生成与否与菌种、培养方式等方面有关，并非所有的红曲霉菌株都会产生橘霉素。因此控制橘霉素可以从菌种、培养条件、方式等几个方面入手。
4.红曲色素对光较为敏感，在红曲色素的提取、保存过程中要注意避光。
参考文献
［1］阮怀贵.红曲色素提取工艺［J］.安徽机电学院学报，1998，13（4）.
［2］石文娟，谭俊，储炬，等.红曲色素高产菌株的高通量选育［J］.中国酿造，2012，31（7）.
［3］郭宝禹，郝林.红曲霉产物的功能及研究进展［J］.酿酒科技，2010（6）.
［4］屈炯.红曲色素组分分离及其功能的初步研究［D］.武汉：华中农业大学，2008.
［5］崔莉，张德权，张培正.红曲色素的研究现状分析［J］.食品科技，2008（8）.
［6］刘颖，红曲色素的固态发酵法制取技术及其稳定性研究［D］.长沙：湖南农业大学，2006.
（编者：戴德慧）
免责声明：以上内容源自网络，版权归原作者所有，如有侵犯您的原创版权请告知，我们将尽快删除相关内容。
