实验四 细菌的分离接种培养及菌落形态观察
一、实验目的
（1）初步掌握微生物的分离、接种和培养的基本方法。
（2）练习微生物接种、移植和培养的基本技术，掌握无菌操作技术。
二、实验原理
微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，为获得生长良好的纯种微生物所用接种方法有所不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等。微生物接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常需采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃涂棒等。
三、实验器材
（一）菌种
大肠杆菌（E．coli）和柠檬色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）24h营养琼脂斜面培养物，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）12～18h营养琼脂斜面培养物。
（二）培养基
灭菌的牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨半固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基。
（三）其他
无菌培养皿、无菌吸管、记号笔、接种环、接种针、酒精灯、火柴。
四、实验步骤
（一）接种
常用的接种方法有斜面接种法、平板接种法、液体接种法及试管半固体培养基的穿刺接种法。
常用的接种工具有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等（见图4－1）。
将各细菌接种至液体培养基、半固体培养基及固体斜面有不同的操作步骤。
图4－1 常用微生物的接种工具
a．接种环 1．塑料套 2．铝柄 3．镍铬丝 4．接种针 5．接种钩 6．接种环
7．接种圈 8．接种锄 b．玻璃刮铲 9．三角形刮铲 10．平刮铲 11．移液管 12．滴管
1．试管菌种接种至液体培养基
（1）将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与食指之间，用右手的中指与食指或食指与小指拔出试管塞并挟出。
（2）置试管口于酒精火焰附近。
（3）将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰三次，然后放入有菌试管壁内，于无菌的培养基表面待其冷却。
（4）用接种环取少许菌种置于另一支液体培养基的试管中，在液体表面处的管内壁上轻轻摩擦以及晃动接种环，使菌体分散并从环上脱开，进入液体培养基。
（5）取出接种工具，试管口和试管塞进行火焰灭菌。
（6）重新塞上试管塞。
（7）摇动液体培养基试管，使菌体在培养液中分布均匀。
（8）烧死接种工具上残留余菌，把试管和接种环放回原处。
2．试管菌种接至半固体培养基
试管半固体培养基利用穿刺接种，用接种针下端取菌种（针必须挺直），自半固体培养基的中心垂直刺入半固体培养基中，直至接近试管底部，但不要穿透，然后沿原穿刺线退出，塞上试管塞，烧灼接种针，如图4－2所示。整个过程无菌操作。
图4－2 穿刺接种
3．试管菌种接种至固体培养基（图4－3）
（1）斜面接种。
①手持试管：将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指位于两试管之间部位。斜面向上，并使它们位于水平位置。
②放松试管塞：右手将试管塞旋松，以便接种时拔出。
③取接种环：右手拿接种环，在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分均用火烧过灭菌。
④拔试管塞：用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的试管塞，然后让试管口缓缓过火灭菌。
⑤环冷却：将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。
⑥取菌种：待环冷却后轻轻沾取少量的菌或孢子，然后将接种环移出接种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。
⑦接种：在火焰旁边迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，不要划破培养基，也可以用接种针在斜面培养基的中央拉一条线作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
⑧塞试管塞：取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将试管塞塞上。塞试管塞时，不要用试管迎试管塞。
⑨环灭菌：将接种环烧红灭菌。放下接种环，再将试管塞旋紧。
图4－3 斜面接种时的无菌操作[1]
（2）平板接种。操作步骤与4．2中微生物的平板划线分离法相同。
（二）分离
分离微生物的方法有很多，其目的都是把混杂的微生物分离为单个细胞使其生长繁殖，形成单个菌落，以便得到纯菌种。
图4－4 倒平板[2]
1．倒平板的方法
右手持盛培养基的三角烧瓶置火焰旁边，用左手将瓶塞拔出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞（也可将瓶塞放在左手边缘或小指与无名指之间夹住。如果三角烧瓶内的培养基一次用完，瓶塞则不必夹在手中）。左手持培养皿并将皿盖在火焰旁打开一缝，迅速倒入培养基约15mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即为平板。
2．划线的方法
平板凝固后，用接种环取相应的菌苔一环在平板上划线。
（1）连续划线法：将挑取样品的接种环在平板培养基表面作连续划线，如图4－5左所示。
（2）三区划线法：用接种环以无菌操作挑取菌种1环，先在培养基的第一区（约占整个平板面积的一半）作第一次连续划线，再转动培养皿约60°角，并将接种环上残余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线，然后作第三次划线，如图4－5中所示。划线完毕，盖上皿盖，倒置于培养箱培养。
（3）分区划线法：将挑取样品的接种环先在培养基上划一条线，将接种环上残余物烧掉，转动培养皿从第一条线上连续划4～6条线，再将接种环上残余物烧掉，转动培养皿从第二次划的线上划过连续划4～6条线，依次类推，直至划满平皿为止，如图4－5右所示。
挑取单个菌落接种于斜面培养基上，如果不纯，再移植纯化，最后得到纯培养。
图4－5 平板划线分离的划线方法
（三）培养
（1）将接种的细菌培养基放在32～37℃恒温箱内培养24h后用于观察。
（2）平板培养基置于恒温箱内倒置培养。
（3）细菌的培养特征如图4－6所示。
图4－6 细菌的培养特征
五、实验记录
（1）固体平板培养基上的培养特征表
（2）固体斜面培养基上的培养特征表
（3）半固体培养基中的培养特征表。
（4）液体培养基中的培养特征表。
六、思考题
（1）平板菌落计数法中，为什么熔化后的培养基需要冷却至45℃左右才能倒平板？
（2）当平板上长出的菌落不是均匀分散的，而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？
参考文献
［1］沈萍，陈向东．微生物学实验［M］．4版．北京：高等教育出版社，2007．
参考资料
［1］袁勇军．应用基础生物实验技术．浙江万里学院．
【注释】
[1]引自百度图库http：／／image．baidu．com／i？ct＝503316480＆z＝＆tn＝baiduimagedetail＆ipn＝d＆word＝斜面接种时的无菌操作。
[2]引自沈萍等《微生物学实验》第3版。
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