大肠杆菌抗药性突变株的筛选

实验十二　大肠杆菌抗药性突变株的筛选

一、实验目的

学习用梯度平板法分离抗药性突变株的原理和方法。

二、实验原理

基因中碱基顺序的改变可导致微生物细胞的遗传变异，这种变异有时能使细胞在有害的环境中存活下来，抗药性突变就是一个例子。微生物的抗药性突变是DNA分子的某一特定位置的结构改变所致，与药物的存在无关，某种药物的存在只是分离某种抗药性菌株的一种手段，而不是作为引发突变的诱导物。在含有一定抑制生长药物浓度的平板上涂布大量的细胞群体，极个别抗性突变的细胞会在平板上长成菌落。将这些菌落提取纯化，进一步进行抗性试验，就可以得到所需要的抗药性菌株。抗药性常用作遗传标记，因而掌握抗药性突变株的分离筛选方法是十分必要的。

在自然条件下，想要获得有抗性的细菌是很困难的。当给予适当的物理化学条件时，其突变率会大大增加，如α射线、β射线、γ射线、Χ射线、中子和其他粒子、紫外线、微波等。DNA对紫外线（UV）有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感，而且紫外线诱变要求实验条件低、试验操作简单，因此，常被用作诱变剂，用于微生物菌种选育。

经诱变处理后的微生物群体中，虽然突变数目大大增加，但所占的比例仍然是整个群体中的极少数。为了快速、准确地得到所需的突变体，必须设计一个合理的筛选方法，以杀死大量的未发生突变的野生型，而保留极少数的突变型。梯度平板法是筛选抗药性突变型的一种简便有效的方法，其操作要点是：先加入不含药物的培养基，立即把培养皿斜放，待培养基凝固后形成一个斜面，再将培养皿平放，倒入含一定浓度药物的培养基，使其凝固，这样就形成了一个药物浓度梯度由浓到稀的梯度培养基。将诱变处理后的菌液涂布于培养基表面，经培养后，在药物浓度比较高的位置出现的菌落就是抗药性突变株。

三、实验器材

（一）菌种

大肠杆菌（Escherichila coli）。

（二）培养基

牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，2×（2倍浓度，营养成分浓度为普通培养基的2倍）牛肉膏蛋白胨培养液（分装于离心管中，每管装5mL），含100μg／mL链霉素的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。

（三）器皿

培养皿（直径6cm、9cm）、玻璃涂棒、移液管、滴管、台式低速离心机、磁力搅拌器等。

（四）试剂及溶液

生理盐水、链霉素溶液。

四、实验步骤

（一）制备菌液

从已活化的斜面菌种上挑1环大肠杆菌于装有5mL牛肉膏蛋白胨培养液的无菌离心管中（接2支离心管），置37℃条件下培养16h左右，离心（3 500rpm，10min），弃上清液后再用生理盐水洗涤2次，弃上清液，重新悬浮于5mL的生理盐水中。将2支离心管的菌液一并倒入装有玻璃珠的三角瓶中，充分振动以分散细胞，制成浓度为108／mL的菌液。然后吸3mL菌液于装有磁力搅拌棒的培养皿（直径6cm）中。

（二）紫外线照射

（1）预热紫外灯：紫外灯功率为15W，照射距离30cm（可在超净工作台中进行）。照射前先开灯预热30min。

（2）照射：将培养皿放在磁力搅拌器上，先照射1min后再打开皿盖并开始计时，照射2min后，立即盖上皿盖，关闭紫外灯。

（三）增殖培养（在暗室红灯或黄灯下操作）

照射完毕，用无菌滴管将全部菌液吸到含有3mL 2×牛肉膏蛋白胨培养液的离心管中，混匀后用黑纸包裹严密，置37℃培养过夜。

（四）梯度培养皿的制备

取10mL牛肉膏蛋白胨琼脂培养基于直径9cm的培养皿中，立即将培养皿斜放，使高处的培养基正好位于皿边与皿底的交接处。待凝固后，将培养皿平放，再加入含有链霉素（100μg／mL）的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基10mL。凝固后，便得到链霉素从0到100μg／mL逐渐升高的浓度梯度培养皿。然后在皿底药物浓度从低到高的方向做一个“→”符号标记。

图12－1　梯度平板示意图

1．底层培养基　2．上层培养基　3．含100μg／mL链霉素　4．培养皿倾斜角

（五）涂布菌液

将增殖后的菌液进行离心（3 500rpm，10min），弃上清液，再加入少量生理盐水（约0．2mL），振荡混匀后将全部菌液均匀涂布于整个梯度培养皿表面，并将它倒置于37℃恒温箱中培养24h。将出现于高药物浓度区域内的单菌落分别接种到斜面上，经培养后做抗药性测定。

（六）抗药性测定

（1）制备含药平板：取链霉素溶液（750μg／mL）0．2，0．4，0．6，0．8mL，分别加到无菌培养皿中，再加入融化并冷却至50℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基15mL，立即混匀，平置凝固后即成为含有10，20，30，40μg／mL链霉素浓度的药物平板，另取一个平板（不含药物）作对照。

（2）抗药性的测定：将上述每个平皿的底部用记号笔划成8等份，并注明1～8号，然后将待测抗药菌株逐个划线接种于上述4种浓度的药物平板和对照平板上，同时每皿留一格接种出发菌株。接种后将培养皿倒置于37℃培养箱中培养过夜。第二天观察各菌株的生长情况，并记录结果。

五、实验记录

将各菌株抗药性测定结果记录于下表中：

注：以“＋”表示生长，“－”表示不生长。

结果：你选到抗药菌株__________株，最高抗药性达__________μg／mL。

六、思考题

（1）未经诱变的菌株在含药平板上是否有菌落出现？为什么？

（2）你选出的抗药性菌株中，如有一抗链霉素的菌株在含药平板上能生长，在不含药平板上反而不生长，这说明什么？

参考文献

［1］沈萍，范秀容，李广武．微生物学实验［M］．3版．北京：高等教育出版社，1999．

［2］周德庆．微生物学实验教程［M］．2版．北京：高等教育出版社，2006．