成骨细胞与骨形成

骨代谢的平衡主要由成骨细胞和破骨细胞维持，成骨细胞与破骨细胞分别具有骨形成和骨吸收的作用。生理状态下，两种细胞的数量和功能处于实时动态平衡中，从而维持骨代谢的平衡，这对于维持骨的正常更新具有非常重要的意义。一旦平衡被打破，随之而来的就是骨代谢稳态的破坏，引起骨量减少，甚至骨质疏松。

成骨细胞有两个基本功能：一是合成骨胶原等细胞外基质，沉积无机盐矿化形成新骨；二是偶联调控破骨细胞功能，实现骨形成和骨吸收的精确平衡，从而使骨量保持稳态。成骨细胞最终发生凋亡或沉积在骨质中形成骨细胞。成骨细胞和骨细胞的凋亡降低骨密度。

成骨细胞来源于骨髓间充质干细胞（MSC）。MSCs是由德国的病理学家Frienden等于1976年在实验中发现的一种多功能干细胞，位于肌肉、骨髓、脂肪组织中，可以分化成为骨骼、软骨、肌肉和脂肪组织。研究表明，MSCs是骨组织发育成熟和重建过程中成骨细胞分化的主要来源，它们渐次分化成为成骨祖细胞、前成骨细胞和成骨细胞。成骨细胞的分化可分为几个阶段，包括增殖、细胞外基质沉积、基质成熟、矿化。

间充质干细胞在分化成为成骨细胞的过程中存在着一个复杂、精密的调节体系，涉及多个骨形成有关的信号通道，受到一系列细胞因子的调控，主要包括BMP、TGF-β、PTH、Wnt和Hedgehogs等。

在成骨细胞不同的表达阶段出现不同的分化标志物，包括碱性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）、骨涎蛋白（BSP）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙素（OC）。ALP代表骨细胞分化的早期标志物，而OC则代表晚期分化的标志物。

具有生物活性的成骨细胞呈圆柱体，排列于骨表面，有细而长的胞质突。成骨细胞核大，呈椭圆形，胞质内有丰富的内质网和较大的高尔基复合体，并有丰富的胶原蛋白分泌小泡。

4.1 TGF-β信号通道

TGF-β超家族包括多个亚家族，如TGF-βs、BMPs、生长分化因子（growth differentiation factors，GDF）、活化素（activins）、抑制素（inhibins）、抗苗勒管激素（AMH）、Nodal等，它们是结构相似、功能不同的肽类物质。

TGF-β是一种多功能的细胞因子，在骨代谢过程中发挥重要作用，主要有三种类型：TGF-β1～TGF-β3。Smad蛋白和Runx2在TGF-β的信号转导过程中具有重要作用。

Smad蛋白是近年发现的重要的细胞内信号传导蛋白，共有8种，分为三类，包括受体调节型Smads，即Smad1、2、3、5、8、9；共同介导Smads，即Smad4；抑制性Smads，即Smad6、Smad7。

Runx2是骨骼生长发育过程中的一种重要的蛋白，是MSCs向成骨细胞分化的特异性转录调节因子，是促进MSCs向成骨细胞分化的早期调控基因，可调节成骨分化。TGF-β和BMP可通过Samd等信号通道调节Runx2的表达。

4.1.1 TGF-β对骨形成的作用机制

TGF-β合成之后，以惰性复合物形式存储于细胞外基质中。骨重建时，破骨细胞可通过创造酸性环境及分泌基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9来释放和激活TGF-β，活化的TGF-β募集MSCs至骨重建位置用于成骨细胞的分化、增殖和新骨形成。

TGF-β有三种受体：Ⅰ型受体、Ⅱ型受体、Ⅲ型受体，其中Ⅰ型受体和Ⅱ型受体在TGF-β信号转导过程中具有至关重要的作用。TGF-β结合并激活Ⅱ型受体，后者进一步激活Ⅰ型受体。另一种观点认为，Ⅰ型受体的活化无须Ⅱ型受体参与。TGF-β与其受体结合后，使得Smad2和Smad3磷酸化，磷酸化的Smad2和Smad3与Smad4结合，进入细胞核内，调节靶基因的转录。Smad2和Smad3在成骨细胞的代谢、增殖过程中发挥重要作用，是TGF-β信号通道发挥靶向作用的重要细胞因子。

4.1.2 TGF-β对骨形成的调节作用

骨形成主要包括三个阶段：MSCs募集于骨形成部位及细胞增殖；成骨细胞分化，并产生类骨质；类骨质矿化。TGF-β对每个阶段都产生影响。

Tang等利用一系列动物模型研究发现，TGF-β对MSCs募集主要是通过ALK5-SMAD2/3-SMAD4信号通道实现的，Smad3在此过程中起主要作用，而Smad2起次要作用。活化的TGF-β进入微环境后可以发挥效应，包括增殖、分化、迁移等。TGF-β可正性或负性影响骨形成，这主要取决于细胞类型与作用时间。比如，TGF-β将MSCs募集至骨重建位置，但它并不诱导成骨细胞的分化。TGF-β可通过促进细胞增殖来增加骨原细胞的数量。也有研究表明，MSCs中加入成骨诱导剂后，TGF-β1mRNA显著升高，ALP活性明显上升，促进骨形成。TGF-β1也能促进成骨细胞的分裂、增殖、分化、成熟，增加成骨细胞的数量与活性。TGF-β也调节了细胞外基质和蛋白酶的合成，包括ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素、骨桥蛋白和基质金属蛋白酶13（MMP-13）。TGF-β促进基质合成最初可能是由于其促进了骨原细胞的增殖，但后期Smad3抑制了Runx2的表达与功能，从而抑制了成骨细胞的分化及基质的合成。TGF-β也通过抑制骨细胞的凋亡而对骨细胞的分化产生影响。

4.2 BMP-Smad信号通道

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是TGF-β超家族中最大的蛋白家族，功能广泛，能有效促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，诱导骨形成，是控制成骨细胞分化的关键因子之一。

成骨细胞膜上有BMP受体（bone morphogenetic protein receptor，BMPR），包括Ⅰ型受体和Ⅱ型受体，BMPs与BMPRⅠ和Ⅱ结合形成复合物，使得Ⅱ型受体被磷酸化从而活化，磷酸化的Ⅱ型受体又进一步激活Ⅰ型受体，活化的Ⅰ型受体与R-Smads结合，导致R-Smads被磷酸化，磷酸化的R-Smads与Smad4结合形成复合物，该复合物进入细胞核内结合到靶基因上，调节靶基因的表达。已有研究报道，BMP-Smad信号调节通路能够调控成骨细胞生命周期的各个阶段，主要包括骨原细胞的扩增、MSC向成骨细胞分化、成骨细胞矿化的活性和能力以及其与破骨细胞的偶联关系。

成骨细胞来源于MSC，许多转录因子在成骨细胞的分化中起着重要作用。Runx2和Os-terix是成骨细胞分化所必需的转录因子。动物研究显示，靶向破坏Runx2或Osterix，可导致成骨细胞分化受阻。此外，尚有一些其他的转录因子可通过与Runx2及Osterix的互相作用，从而对成骨细胞的分化产生影响，这些转录因子包括PPARγ、Msx2、Sox9及ATF4等。

大量研究表明，BMP信号通道的活化可促进成骨细胞的形成。BMP-Smad信号上调了Runx2的表达，Runx2与Smad1/5/8相互作用，激活转录的下游基因，进而促进成骨细胞的分化。Matsubara等研究发现，Runx2与Mxs2在经典的BMP信号通道激活Osterix的表达过程中具有重要作用。而TGF-β诱导的Smad3可阻断Runx2的作用。然而，在体研究中，在利用BMP-2诱导Osterix的表达过程中，Runx2必不可少。体外研究也显示，Runx2基因敲除的MSC细胞其Osterix转录受阻，但给予Runx2后可激活其转录。

基于以上发现，部分学者通过抑制BMP信号通道抑制成骨细胞的分化。McBride发现，条件性敲除成骨细胞源性BMP-2可降低骨量，改变骨的结构与力学性能，而敲除血管内皮细胞的BMP-2则对骨量无任何影响。G蛋白偶联受体激酶相互作用蛋白1（kinase2-interac-tingprotein-1，GIT1）在骨折愈合过程中发挥重要作用。Sheu等发现，GIT1基因敲除小鼠骨折愈合延迟，进一步研究发现，GIT1基因敲除小鼠的MSC中的BMP-2的表达量下降， Smad1/5/8磷酸化水平降低，Runx2表达下降，骨形成能力下降，从而导致骨折愈合延迟。BMP-3可抑制BMP-2和BMP-4，从而抑制BMP-SMAD信号通道，进而抑制成骨细胞的分化。SMURF1通过作用于Runx2，从而阻断成骨细胞的早期分化。此外，抑制性Smad（Smad6和Samd7）也可下调成骨细胞的分化。Smad6过表达可抑制BMP-2诱导的C2C12细胞向成骨细胞分化，而BMP-2和BMP-7可负反馈性上调Smad6的表达。Smad7基因敲除的小鼠成骨功能不全，而破骨细胞的活性却增强，显示Smad7可抑制骨形成，促进骨吸收。

4.3 Hedgehog信号通道

在人体中有三种Hedgehog（Hh）：Sonic、Indian和Deserthedegehog，它们对平衡成骨细胞和破骨细胞的活性至关重要。Indian hedegehog（Ihh）可调节骨与软骨的发育，是成骨细胞发育所必需的。敲除Ihh基因的小鼠软骨内成骨所形成的骨骼中不含有成骨细胞。Ihh可正性调节颅骨的发育，并且也可调节BMP信号通道。

细胞对Hh信号的反应受两种跨膜蛋白控制，分别是肿瘤抑制物12次跨膜蛋白Patched-1（Ptch）和7次跨膜受体及癌蛋白Smoothened（Smo）。Hh对信号转录的作用是由转录因子Gli介导的，Gli2介导Hh增加Runx2的表达和功能来调节成骨细胞分化。Hh不仅调节成骨细胞，也调节破骨细胞的形成。

4.4 Wnt信号通道

Wnt为一种分泌性糖蛋白，经典的Wnt/β-catenin信号通路包括以下组成部分：Wnt蛋白、Wnt受体（Frizzled家族蛋白及低密度脂蛋白受体相关蛋白（LDL receptor related protein， LRP））、Dishevelled（Dsh/Dvl）蛋白、β-连环蛋白（β-catenin）、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）、Axin/Conductin、APC（adenomatous polyposis coli）蛋白等。Wnt与其受体结合后，将信号传导到β-catenin，进而启动靶基因的转录。

（沈光思、赵国阳）