破骨细胞与骨吸收

5.1 破骨细胞的形成与分化

一般认为，破骨细胞（OC）来源于CD34阳性的骨髓造血干细胞，这些CD34阳性的骨髓造血干细胞是骨髓中的单核/巨噬细胞系的前体细胞。一些早期因子的活化如PU1和MITF使未分化的骨髓造血干细胞转变为髓样前体细胞。后者随着集落刺激因子（M-CSF）的表达并与其受体c-Fms结合后，进一步激活OC前体细胞增生并使细胞骨架重构，使其向单核细胞/巨噬细胞系分化，同时诱导RANK（核因子κB受体活化因子）的表达，形成了经典的OC前体。在NF-κB和NFATc1等转录因子的作用下，OC前体活化并暴露于RANKL（核因子κB受体活化因子配体），这对于正常的OC分化和后续骨吸收能力的形成是个重要刺激，然后经过OC分化成熟因子以及多条信号通路的作用，最终分化发育融合形成成熟的OC。

OC分化过程中几条重要的信号通路：

5.1.1 OPG/RANKL/RANK通路

RANK是属于肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体超家族的一员，在OC前体、成熟OC、树突状细胞等表面表达，其配体RANKL由成骨细胞（OB）及其前体、T细胞、B细胞和巨核细胞产生。而OPG对RANKL具有高亲和力，与RANKL竞争性结合，抑制RANKL与RANK的结合，从而阻遏OC的分化和成熟，阻滞骨的吸收。当OB前体细胞在骨吸收过程中接收到刺激信号后会表达RANKL，RANKL与其在OC前体细胞表面表达的受体RANK结合后，通过与TNF受体连接因子（TRAF）家族成员的交互作用活化NF-κB、c-Fos、MAPK、Src-P13K-Akt、NFATc1等信号调节通路发挥相应的作用。

TRAF（tumor-necrosis factor receptor associated factors，肿瘤坏死因子受体相关因子）目前已发现有6个成员（TRAF1-6），它们均可与RANK的氨基酸位点相结合。现已证实，TRAF6在维持OC骨吸收作用和细胞骨架形成等方面是必不可少的，其功能不能被TRAF2和TRAF5所代替。而且，RANK通路可参与OC分化与功能的调节。此外，某些细胞因子也可通过TRAF6发挥作用。因此我们认为，TRAF6在RANKL与RANK结合后细胞内的信号传导通路中起枢纽作用。

5.1.2 NF-κB经典信号通路

NF-κB是NF-κB/Rel家族的一种重要的转录因子。在静默条件下，NF-κB与其抑制性蛋白ⅠκB组成三聚体（P50-P65-ⅠκB）而呈非活性状态，但当NF-κB受到启动因子刺激时，ⅠκB即从三聚体中解离出来，NF-κB二聚体（P50-P65）从细胞质易位到细胞核，与相应靶基因的启动子结合，通过启动或调控基因的转录来调节OC分化成熟或凋亡。有实验还表明， NF-κB对于巨噬细胞的募集和成熟以及一些炎症因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6和MCP1）的产生发挥着重要作用。

5.1.3 c-src-PI3K-Akt信号通路

实验研究证明，靶向阻断c-src的小鼠呈现出骨质硬化的现象，提示c-src在OC活化过程中可能起重要作用。TRAF6使c-src激活，c-src反过来刺激磷脂酰肌醇-3激酶（phosphati-dyl inositol 3-kinase，PI3K），激活的PI3K使Akt活化，Akt又通过下游效应器AFX/FOX04来抑制OC凋亡，调节OC骨架重置和细胞移动，从而促进其存活。2012年，Moon等证实，通过活化GSK3β/NFAtc1级联信号，活化的Akt可以诱导OC分化，而PI3K家族的另一个成员PI3Kγ却可以降低OC的生成。

5.1.4 MAPK（mitogen activated protein kinases，促分裂原活化蛋白激酶）通路

MAPK通路通过三级酶促级联反应放大传递信号，即MAPK激酶的激酶（MAPKKK，又称MEKK）—MAPK激酶（MAPKK，又称MKK）—MAPK。激活的信号主要通过激活C-fos和NFAT等下游调控分子刺激OC的分化。该信号通路主要包括ERK MAPK、JNK MAPK以及p38 MAPK三条路径。

（1）ERK（细胞外信号调节激酶）MAPK通路

RANKL与RANK结合后诱导活化受体Tyr激酶，其结构域SH2将募集受体结合蛋白2 （Grb2），该蛋白与鸟嘌呤核苷酸交换因子（Sos）相互结合形成复合物，Sos一方面与受体结合，另一方面会移位至胞浆并与Ras发生相互作用，促进Ras与GTP结合，瞬间形成Ras-GTP并活化膜上Raf激酶，然后再顺序活化MAPKK和ERKI/ERK2，ERK易位进入核内，在核内活化转录因子Elk并与c-fos基因启动子中的顺序调控元件即血清反应元件（SRE）结合，从而调节C-fos基因的转录，最终将成熟的巨噬细胞转变成前体OC。

（2）JNKMAPK通路

Rho家族通过受体酪氨酸激酶介导生发中心激酶（germinal center kinase，GCK/NIK）的活化，而后依次激活MEKK1/2/3/4和MEK4/7，最终活化JNK，使其从胞浆移位至细胞核。活化的JNK可诱导AP-1活化，启动MMPs和碱性磷酸酶等基因的编码，从而刺激OC前体的分化、生存、融合以及活化成熟的OC。

（3）P38（38KD的酪氨酸磷酸化蛋白激酶）MAPK通路

OC前体上RANKL与RANK结合后，促进MEK6的磷酸化，进而激活P38 MAPK。活化的P38从胞浆移位到细胞核，进一步磷酸化转录因子MITF，最终促进OC的分化。研究表明，抑制P38 MAPK信号途径可以抑制OC分化和局部骨吸收。

5.1.5 CN/NFAT（Calcineurin，钙调磷酸酶/nuclear factor of activated T cells，活化T细胞核因子）通路

CN/NFAT是OC内与RANK相关的又一信号转导通路。我们已知，不同转录因子的活化都依赖Ca2+信号，NFAT的活化就是依赖于持续低浓度的Ca2+，而且研究发现Ca2+振动可以降低转录因子活化时的Ca2+阈值。当Src蛋白激活IP3时，后者引起钙库释放，细胞浆内Ca2+水平增加。NFAT是一种Ca2+调节性转录因子，包括NFAT 1-4。NFAT被CN活化后，快速易位进入细胞核启动基因的转录。其中，NFATc1通过控制OC相关基因在调节OC分化进程中扮演着主要角色，而c-fos是诱导NFATc1活化的重要因子。在OC分化的最后阶段，NFATc1扮演着最末梢的转录因子来调节OC相关基因如TRAP、OSCAR、DC-STAMP、组织蛋白酶K和cscr的表达。最近有研究证实了Akt-NFATc1信号轴在OC分化过程中的重要性，抑制Akt的磷酸化可降低RANKL诱导的NFATc1的活化从而抑制OC的分化。

5.2 破骨细胞的形态与标志酶

5.2.1 破骨细胞的形态

OC是一种多核巨细胞，其核2～100个不等，但大多数情况下每个细胞含有10～20个核。OC位于Haversian系统骨膜的内表面，其直径可达到100μm。与多核巨细胞相比，OC具有特征性的皱褶膜，这种皱褶膜在质膜与骨的结合处由胞质突出形成手指样的结构，骨矿物质的降解与吸收就在皱褶膜下发生，细胞通过皱褶膜向封闭区内释放蛋白水解酶和氢离子。OC在骨组织中的相对数量很少，每立方微米的骨组织仅有2～3个破骨细胞，但在骨转换比较活跃的部位如干骺端，其数目较多。

另外，OC还含有大量的溶酶体，在近核区还常有广泛的高尔基体。胞质含有密集的核心颗粒，核通常位于细胞中央，其形态具有高度可变性，每个核仁含有1～2个明显的核小体。OC的粗面内质网非常稀少，而游离核糖体众多。扫描电镜观察表明，OC与骨面接触时，开始形成空腔样结构，微绒毛在皱褶膜与骨组织的交界面形成骨陷窝。OC的皱褶膜含有许多亚结构，如空泡H+-ATP酶、rab-7及α-肌动蛋白的致密体等。各种亚结构能完成不同的功能，并相互配合，使骨吸收顺利进行。

5.2.2 破骨细胞标志酶

①抗酒石酸酸性磷酸酶：在一般情况下，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）可作为OC的一种标志物，尤其是TRAP-5b被认为是OC很特异的生物酶。人和鼠的TRAP基因均已克隆，在5′端有两个启动子，分别作为正性和负性调节元件而起作用。由于TRAP在正常组织中表达具有较强的特异性，因而可以使转基因鼠的特异性基因在OC中靶向表达。但是，TRAP的生理功能目前尚不完全清楚。使用抗TRAP的抗体阻抑法发现TRAP在OC骨吸收过程中发挥重要作用。OC骨吸收时，位于OC微粒体的TRAP通过OC皱褶缘分泌至酸性吸收腔隙，与其他酶类一起对骨基质进行降解。

②Ⅱ型碳酸酐酶：碳酸酐酶是一类参与体内很多重要生理变化的金属酶，根据碳酸酐酶氨基酸序列的区别，分为α、β、γ、δ、∈五种类型，Ⅱ型碳酸酐酶（CAⅡ）属α型碳酸酐酶众多同工酶中的一种。CAⅡ在OC骨吸收过程具有重要的调节作用，其不仅可控制H+的分泌，还能影响OC的分化及移动，并通过改变胞内Ca2+浓度与吸收腔隙中的pH而产生作用。

③组织蛋白酶K（CTSK）：CTSK是一种半肌氨酸蛋白酶，属于番木瓜家族中的一员，具备番木瓜家族前多肽原的典型结构，可促进酶原产生溶酶体的靶向作用。低酸性的骨吸收腔隙是CTSK激活所依赖的微环境，该环境中较低的pH不仅可以促使形成功能化学键，还可以自动断开其前端的部分，使催化基质降解的酶原活性位点暴露，构象发生改变，最终形成成熟的具有活性的CTSK。CTSK在胎盘、心脏、骨骼肌、小肠等多组织中表达，尤其是在OC或破牙质细胞中广泛存在，对降解骨基质蛋白起着非常重要的作用。

④基质金属蛋白酶-9（MMP-9）：MMP-9是基质金属蛋白水解酶超家族中锌结合肽链内切酶家族的一员，亦称明胶酶B，主要功能是降解或重建细胞外基质。MMP-9是体内重要的蛋白酶之一。MMP-9通常在中性pH的环境中产生作用，并依赖金属锌离子，若Ca2+参与，其活性更高。MMP-9可降解Ⅰ型胶原的α2链，以及Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原明胶。有研究表明，在破骨细胞前体分化为破骨细胞过程中，MMP-9的产生比TRAP还要早，提示其可能有其他更为重要的作用机制。

5.3 破骨细胞的骨吸收功能

OC成熟后具有骨吸收能力，骨吸收分为三个阶段，即OC吸附于矿化的骨组织、OC极化、OC吸收骨组织和终止骨吸收过程。

5.3.1 骨吸收启动期

在骨吸收启动期，OC吸附于矿化的骨组织，吸附过程由整合素介导，OC黏附的部位称为伪足小体，伪足小体变为致密的充填环，并形成一个密封的骨吸收微环境，OC极化释放出质子和蛋白酶，降解骨基质。

5.3.2 骨吸收初期

OC与骨表面接触后，其腹部覆盖在骨表面，其背部与骨髓接触，称为基胞区。在覆盖区的周边，由游离核糖体组成的均质状透明带把细胞边缘和骨表面封闭起来。透明带通过足体与骨表面相连，足体内的长束状肌动蛋白细丝可穿越细胞膜，通过粘连蛋白与细胞外基质相连，使被覆盖区形成一个封闭的微环境，这一过程称为OC的黏附。成熟OC分泌的整合素在黏附阶段起主要作用，整合素促进骨基质和OC之间的黏附，封闭区就在皱褶膜形成，其形态和作用相当于由细胞内许多酸性小囊泡融合而成的细胞器，构成骨吸收的微环境。

羟基磷灰石溶解是骨吸收的最初阶段。在骨吸收进行时，OC的骨吸收活性可被OC分解的基质胶原进一步促进，其机制可能是分解的基质胶原在OC的细胞骨架重新构建组合时，不断将H+-ATP酶从胞质贮存池转运到刷状膜处。在封闭区OC胞质内产生大量碳酸酐酶Ⅱ，形成盐酸，矿物质在盐酸的作用下溶解。在骨吸收的过程中，质子泵的作用至关重要。质子泵是一种存在于真核细胞膜内，水解ATP产生能量、推动H+逆浓度梯度跨膜转运的能量依赖性转移系统，简称H+-ATP酶。OC的H+-ATP酶定位于皱褶膜为空泡型质子泵，而静态OC的V-ATP酶分布于胞质内的空泡膜系统。当OC附着在骨表面时，细胞骨架发生改变，空泡膜系统向紧邻骨面的包膜移动并与之融合形成皱褶膜，质子泵就密集在皱褶膜上。OC的V-ATP酶转运H+的机制为电子源性。许多与骨吸收相关的激素和药物如甲状旁腺素、二膦酸盐等均与V-ATP酶有关。

5.3.3 骨吸收期

在骨的矿物质被溶解吸收后，接下来就是骨的有机物质的吸收和降解。此时，OC开始合成蛋白水解酶并分泌到骨吸收的封闭区内。最主要的蛋白水解酶为CTSK和MMP-9。Solo等利用示踪实验观察了骨吸收过程中骨基质成分的转运过程。在骨吸收过程中，游离的骨基质颗粒一旦被释放出来，就被OC皱褶膜通过胞饮方式吸收，然后隐藏在OC胞质内的膜结合小囊中。这些囊泡与其内容物再与其膜上的“功能性分泌区”（FSD）融合。实验发现，这个区域内的胞质框架改变后可以看到降解后的有机物质或无机颗粒释放。而且，释放的成簇基质降解产物被细胞吞饮后，又可通过胞吐作用而释放到细胞外间隙。OC释放出吞饮的基质后经历一系列生理改变而转向凋亡。随后以此为转折点，在骨吸收的部位又重新开始新骨形成。

5.4 破骨细胞骨吸收的调节

5.4.1 激素

①甲状旁腺素（PTH）：PTH既能刺激骨吸收、抑制OB的活性，又能促进骨形成，但是前者大于后者。持续的PTH能抑制骨胶原的合成，从而抑制骨形成；而间断的PTH可以促进骨胶原的合成及骨形成。

②降钙素（CT）：降钙素是甲状腺细胞分泌的一种多肽，可抑制OC的形成，降低成熟OC的骨吸收能力。降钙素抑制OC前体及成熟OC内降钙素受体mRNA的表达。

③1，25-（OH）2D3：1，25-（OH）2D3是OC形成及骨吸收的活化剂。1，25-（OH）2D3能促进OC前体向成熟的OC分化，使无骨吸收活性的OC募集并发育成具有骨吸收活性的OC，从而增加OC的数量，引起骨吸收的增加。

④雌激素：近年来研究表明，OC具备雌激素受体，雌激素与受体结合以后，通过细胞间信号传导通路使OC内产生一系列反应，进一步抑制OC的骨吸收功能。雌激素还可以通过一些细胞因子（如IL-1、IL-6等）影响OC的增殖、分化、成熟以及活性。

⑤前列腺素（PG）：小剂量的PGs对OC起抑制作用，外源性大剂量的PGE对OC和OB都会产生影响，进一步打破两者在机体内的自身平衡，结果使机体朝着有利于骨吸收的方向发展。

⑥微量元素：铁可促进OC的分化和骨吸收。锌可抑制OC的形成，锌可能是OC膜质子泵的抑制剂，对骨吸收有直接的抑制作用。同时，锌能刺激TGF-β的产生，TGF-β可抑制OC的形成及其功能。

5.4.2 破骨细胞活化因子

①集落刺激因子（CSFs）：CSFs由骨髓微环境中的巨噬细胞、内皮细胞、基质细胞等产生，其在体内、外均可诱导造血祖细胞的集落生长。相关实验研究证明，集落刺激因子能刺激OC的形成。

②白细胞介素-1（IL-1）：IL-1可以诱导OC单核前体细胞融合，形成类破骨多核细胞，还可以通过酪氨酸激酶——NF-κB途径上调OC的CTSK表达，促进骨吸收。

③白细胞介素-6（IL-6）：IL-6由单核巨噬细胞、破骨细胞、成骨细胞和骨髓基质细胞等产生。IL-6的作用与其浓度有关，低浓度可刺激OC的形成，较高浓度可刺激成熟的OC吸收。

④白细胞介素-11（IL-11）：IL-11以旁分泌的形式参与OC的形成。它通过促进OC的生成和使OB介导的类骨质发生退变而增强骨吸收。

⑤肿瘤坏死因子-β（TNF-β）：TNF-β在骨髓培养系中有促进破骨样细胞的形成、影响成熟OC的活性和增强IL-1促进OC形成的作用。TNF-α直接诱导OC分化并刺激其活性，还可通过影响OPG/RANKL/RANK信号系统以旁分泌形式调节OC分化、刺激骨吸收。

⑥转移生长因子α（TGF-α）：TGF-α通过与表皮生长因子受体结合来促进OC的骨吸收，另外还可刺激早期破骨母细胞的增生。

⑦NF-κB受体活化因子配体（RANKL）：RANKL受很多因素调节，如PTH、PG和1，25-（OH）2D3等，它能促进破骨母细胞的分化、活化OC以及增强骨吸收。

⑧氧自由基：氧自由基能刺激OC的形成和骨吸收。有研究发现，超氧化物歧化酶可抑制PTH及IL-1刺激的骨吸收。

5.4.3 破骨细胞抑制因子

①γ干扰素（IFN-γ）：IFN-γ是OC形成和骨吸收的抑制剂，能抑制破骨样多核细胞的形成。IFN-γ可通过激活抗原依赖的T细胞，间接刺激OC的形成，促进骨的吸收。

②骨保护素（OPG）：OPG不但抑制OC生成，还能抑制骨吸收。体外实验证实，骨保护素可诱导OC的凋亡。OPG还可拮抗促骨吸收因子1，25-（OH）2D3和PTH等引起的骨吸收。

③转化生长因子β（TGF-β）：TGF-β可通过抑制破骨前体细胞的增殖和分化来抑制OC的形成。TGF-β也能通过改变酸性磷酸酶和抗酒石酸酸性磷酸酶活性来直接抑制OC骨吸收功能。

④白细胞介素-4（IL-4）：IL-4能抑制OC的形成和骨吸收。IL-4可通过影响RANKL/RANK/OPG系统来抑制OC的分化和骨吸收。

⑤二磷酸盐：二磷酸盐作为OC骨吸收的抑制剂，可结合到骨基质的表面，抑制OC溶酶体酶的释放和蛋白激酶的活性，从而抑制OC的骨吸收。

（赵国阳）