锥形瓶与培养瓶

三、实验步骤

（1）制备磷酸缓冲液：KH₂PO₄3．4g；K₂HPO₄8．7g；Na₂HPO₄13．36g；蒸馏水200ml。

（2）无机盐溶液：MgSO₄·7H2O 100ml，22．5g/L；CaCl₂100ml，27．5g/L；FeCl₃·6H2O，0．25g/L。

（3）氯化铵储备液：NH₄Cl3．82g溶于100ml蒸馏水中，使用时，可按需要对储备液进行1:1 000、1:50稀释，获得1:1 000、1:50的氮源使用液。

（4）Tris缓冲液：1．21g三羟甲基胺基甲烷溶于50ml蒸馏水中。

（5）葡萄糖储备液：10g葡萄糖溶于100ml蒸馏水，使用时，可稀释获得葡萄糖使用液为10 000mg/L（取10ml葡萄糖储备液稀释到100ml中）。

（6）分别制备溶液1、溶液2。

溶液1：加入磷酸缓冲液150mL，22．5g/L的MgSO₄·7H2O 1ml，27．5g/L CaCl₂1ml，0．25g/LFeCl₃·6H2O1ml，蒸馏水600ml。

溶液2：NH4Cl溶液15ml，蒸馏水735ml。

（7）含不同浓度葡萄糖培养液的制备：取100ml溶液1和100ml溶液2，制成混合液；将混合液取25ml分装到8个50ml的锥形瓶中；再分别取葡萄糖使用液0、0．625、1．25ml和储备液0．25ml、0．5ml、0．75ml、1ml、1．25ml于锥形瓶中，获得GM1－8，葡萄糖浓度分别为0mg/L、250mg/L、500mg/L、1 000mg/L、2 000mg/L、3 000mg/L、4 000mg/L、5 000mg/L；每个试管移装5ml，对应贴标签GM1，GM2，…，GM8，备用。

（8）含不同浓度氮培养液的制备：于10个50ml锥形瓶中，按照表5－1所示，各溶液分别取不同体积，使配成含不同浓度氮的培养液。然后分别移5ml培养液于试管中，对应贴标签N1，N2，…，N10，备用。

表5-1　含不同浓度氮培养液的制备配方

（9）不同pH营养液的制备：取150ml溶液1和150ml溶液2于500ml锥形瓶A中混合，取一半倒入另一洁净250ml锥形瓶B中，用NaOH调节pH为8，然后取25ml于50ml锥形瓶C中，加入1．25ml葡萄糖储备液，获得pH为8的营养液；再用NaOH调节B瓶中溶液使pH为9后，取25ml与另一50ml锥形瓶D中，加入1．25ml葡萄糖储备液，获得pH为9的营养液；依次操作，直到pH为11。A瓶中剩余混合液，用H₂SO₄调节pH为7，然后取25ml于另一50ml锥形瓶G中，加入1．25ml葡萄糖储备液，获得pH为7的营养液；再用H₂SO₄调节A瓶中溶液使pH为6，重复上述操作，依次获得从pH＝2到pH＝11的培养液。将这些不同pH的培养液，移取5ml分装于试管中，对应贴上标签pH2，pH3，…，pH11，备用。

（10）含不同浓度磷培养液的制备：首先制备溶液A，称1．21g Tris溶于50ml蒸馏水中，加入44．2ml0．2M的HCl，调节pH为7．2，使溶液体积为100ml；另取氯化铵溶液4ml、22．5g/L的MgSO₄·7H2O 0．267ml、27．5g/L的CaCl₂0．267ml、0．25g/L的FeCl₃·6H2O 0．267ml，溶于蒸馏水中，稀释到100ml，获得溶液B；最后混合溶液A、B，得到200ml混合Tris溶液；取10ml磷酸盐缓冲液，稀释到25ml，得到磷使用液。于9个50ml锥形瓶中，按下列方法配制含不同浓度磷的培养液，见表5－2。将不同浓度磷的培养液分装试管，每个试管移装5ml，对应贴标签P1，P2，…，P9，备用。

表5-2　含不同浓度磷培养液的制备配方

（11）不同电子供体、电子受体培养液的制备：分别取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入3ml葡萄糖储备液，得到混合液；取20ml混合液于50ml锥形瓶中，得到G1；取5ml混合液于试管中，得到G2，分别贴标签G1、G2。

另再分别取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入3ml葡萄糖储备液、0．375g硝酸钠，得到混合液；取5ml混合液分装于试管中，得到G3，贴标签G3。

另再分别取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入0．69g醋酸钠，得到混合液；取20ml混合液于锥形瓶中，得到A1；其余取5ml分装于试管中，得到A2，分别贴标签A1、A2。

另再分别取75ml溶液1和75ml溶液2混合，加入0．69g醋酸钠、0．375g硝酸钠，得到混合液；取5ml混合液分装于试管中，得到A3，贴标签A3。

上述各步，可根据教学课时灵活掌握。时间不充足，可由实验员准备到这一步。上述制备数量为5组，可根据学生人数，进行等比例放大缩小。

（12）接种与培养：分别对具5ml培养液的试管、20ml培养液的锥形瓶接种0．5ml、2ml沉降好的污泥；往贴好标签G2、G3、A2、A3的试管、培养瓶倒入溶解好的蜡于液体表面，防止液体与空气接触，使成厌氧条件。G1、A1不倒蜡于液体表面。

用带砂芯的橡胶塞将试管口和锥形瓶瓶口部塞住，在35℃下培养48小时。

（13）测量：48小时后，回到实验室，摇晃使每个试管充分混匀；在420nm波长下，用分光光度计测定其吸光度，并记录数据。

思考题

1．实验前，请思考不同浓度葡萄糖营养液培养组中微生物生长的规律并说明理由。实验结果是否与你预期的一致？为什么？

2．实验前，请思考不同浓度氮营养液培养组中微生物生长的规律并说明理由。实验结果是否与你预期的一致？为什么？

3．实验前，请思考不同浓度磷营养液培养组中微生物生长的规律并说明理由。实验结果是否与你预期的一致？为什么？

4．实验前，请思考在不同电子供体、电子受体的实验中微生物生长的规律并说明理由。试验结果是否与你预期的一致？为什么？

5．把A1、A2、A3培养液的醋酸盐换成乙醇，微生物的生长情况如何？

6．详细描述实验现象，分析实验过程出现的错误，并分析原因。