细菌纯种分离的操作方法

六、细菌纯种分离的操作方法

细菌纯种分离的方法有两种：稀释平板法和平板划线法。

（一）稀释平板分离法

1．取样

用无菌锥形瓶到现场取一定量的活性污泥或土壤或湖水，迅速带回实验室。

2．稀释水样

工作前，用镊子取出一块酒精棉球擦手、镊子以及工作台，待工作台干净后，点燃酒精灯。

将1瓶90ml和5管9ml的无菌水排列好，按10^－1、10^－2、10^－3、10^－4、10^－5及10^－6依次编号。在无菌操作条件下，用10ml的无菌移液管吸取10ml水样（或其他样品10g）置于第一瓶90ml无菌水（内含玻璃珠）中，将移液管吹洗3次，用手摇10分钟将颗粒状样品打散。即为10^－1浓度的菌液。用1ml无菌移液管吸取1ml的10^－1浓度的菌液于一管9ml无菌水中，将移液管吹洗3次，摇匀即为10^－2浓度菌液。用同样的方法依次稀释到10^－6。稀释过程如图8－6所示。

图8－6　样品稀释过程

3．平板的制作

取10套无菌培养皿编号，10^－4、10^－5、10^－6各3个，另1个为空气对照。取1支1ml无菌移液管从浓度小的10^－6菌液开始，以10^－6、10^－5、10^－4为序分别吸取0．5ml菌液于相应编号的培养皿内（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹吸使菌液充分混匀）。或者直接用微量移液枪移取0．5ml菌液，每移一次换一个枪头，移取液体前，用70%乙醇对进入试管的枪体进行擦拭消毒（图8－7）。

图8－7　倒平板与接种

加热融化已灭菌的培养基，当培养基冷却至45℃左右时，进行无菌操作倒平板，具体过程见图8－7。倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和反时针来回转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置于30℃恒温箱中培养48小时，然后观察结果（注：若在无菌室内操作，倒平板按图8－8操作）。

取“对照”的无菌培养皿，待平板待凝固后，打开皿盖10分钟后盖上皿盖，倒置30℃箱中培养，48小时后观察结果。

图8－8　倒平板

（二）平板划线分离法

1．平板的制备

将融化并冷至50℃的肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。

2．操作

用接种环挑取一环活性污泥（或土壤悬液等），左手拿培养皿，中指、无名指和小指手托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线（切勿破坏培养基），划线的方式可取图8－9中任何一种。划线完毕盖好皿盖，倒置30℃恒温箱中培养48小时后观察结果。

图8－9　平板划线分离方法

A．操作示意；B．平板分区5区法；C．平板分区3区法