根瘤菌和豆科植物的共生固氮

三、根瘤菌和豆科植物的共生固氮

根瘤菌(Rhizobia)和豆科植物的共生固氮作用是微生物和植物之间最重要的互惠共生关系。豆科植物被特定的根瘤菌感染后，植物和根瘤菌的生理都发生变化，形成根瘤(root nodules)。根瘤是根瘤菌和植物根彼此单独存在时所没有的形态结构，也具有彼此单独存在时所没有的固氮功能。共生固氮对保持土壤肥力，提高农作物产量有重要作用。

与自由生活的固氮菌相比，共生固氮菌的固氮能力大大增强。例如，自由生活的固氮菌的联合固氮作用每年每公顷可固氮25kg，而粮食类豆科植物(如豌豆、蚕豆和大豆等)形成的根瘤能固定植物所需总氮量的50%，固氮速率大大提高，每年每公顷能固氮100kg;草料豆科植物(如紫花苜蓿和三叶草)可固定其所需总氮源的大部分氮，每年每公顷能固氮200kg到300kg。因此，豆科植物和根瘤菌形成的根瘤共生体对农业生产具有重要的意义，能显著增加土壤中化合氮的含量，使豆科植物在贫瘠的土壤中生长良好。豆科植物很多，包括非常重要的农作物如豌豆、蚕豆、大豆、紫花苜蓿和一些结荚植物。能在豆科植物上结瘤的固氮细菌都属于能运动的革兰氏阴性杆菌，包括根瘤菌(Rhizobium)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、中华根瘤菌(Sinorhizobium)和固氮根瘤菌(Azorhizobium)共4个属16个种。

1.根瘤的发生和发育

根瘤的形成是植物和根瘤菌由遗传因素决定的一系列复杂过程共同作用的结果。根瘤菌与豆科植物之间的共生是专一性的。一种根瘤菌菌株通常只能感染某一种特定的豆科植物。一根瘤菌群只能感染相应交互接种群(cross-inoculation group)中的豆科植物。

并不是所有根瘤菌感染植物所形成的根瘤都具有固氮能力。如果根瘤菌是无效的，它所形成的根瘤就是不具有固氮能力的无效根瘤;无效根瘤个体小，数量多，表面光滑，切断面呈白绿色。如果根瘤菌是有效的，它所形成的根瘤就是具固氮能力的有效根瘤;有效根瘤个体较大，表面光滑或有皱纹，剖面呈粉红色或红色。

根瘤菌感染豆科植物形成根瘤的过程主要包括以下几个阶段:

1)根瘤菌和相应豆科植物之间的相互识别以及根瘤菌在植物根毛上的吸附。结瘤早期豆科植物根系可分泌多种有机物，如类黄酮化合物、少量酚类化合物和甜菜碱等，这些化合物对根瘤菌具有趋化作用，使得根瘤菌被吸附到植物根毛表面，在植物根部大量繁殖聚集。所有根瘤菌和慢性根瘤菌都能在菌表产生钙结合蛋白(rhicadhesin)，并利用这种钙结合蛋白在根毛上吸附。其他一些物质如被称为植物凝集素(lectins)的植物糖蛋白，在植物与根瘤菌吸附的过程中也发挥着重要的作用。

2)根瘤菌侵入根毛形成侵染线(infection thread)。在根瘤菌分泌的结瘤因子(nod factors)作用下，根毛细胞壁变软，根毛发生卷曲，根瘤菌从变软的细胞壁进入根毛。在根瘤菌进入根毛细胞的部位，根毛细胞壁内陷，并开始分泌一种含纤维质的物质，将根瘤菌包围起来，形成一条管状结构的侵染线(infection threads)。

3)根瘤菌通过侵染线向主根推进。根瘤菌在侵染线内不断繁殖，并沿侵染线不断向根毛基部和表皮细胞延伸。

4)根瘤菌在植物细胞中转变为变形的菌细胞——类菌体(bacteroids)，发展为固氮状态。当侵染线到达根的皮层细胞后，它的前端膨大，不再形成侵染线壁，根瘤菌被释放到植物细胞中。从侵染线释放出的根瘤菌在细胞中迅速地大量繁殖，并转变成逐渐膨大、畸形和分叉的类菌体。单个或多个类菌体被部分植物细胞膜包裹，形成共生体(symbiosome)。只有当共生体形成以后固氮作用才开始。

5)根瘤菌和植物细胞继续分裂，形成成熟的根瘤。植物开始衰老时，根瘤逐渐衰退，类菌体将最终从根瘤中被释放入土壤。被释放出的类菌体不具有分裂增生的能力，但总会存在一小部分休眠的杆状细胞。这些杆状细胞能利用衰退根瘤的产物为营养进行增殖扩散，并能感染其他植物根或在土壤中游离生活。

2.根瘤形成的遗传基础

根瘤的形成取决于结瘤基因的存在。根瘤菌感染豆科植物形成根瘤的过程中，指令特定结瘤步骤的基因被称为结瘤基因。结瘤基因大多与结瘤因子(nod factors)的合成和外运有关，这些基因可分为调节基因(Nod D)、共同结瘤基因(common nodulation genes，Nod A，B，C)和寄主特异性结瘤基因(host-specific nodulation genes)3类。对于根瘤菌(Rhizobiumspp.)来说，结瘤基因大多数位于质粒(plasmids)上，而慢性根瘤菌属(Bradyrhizobiumspp.)、固氮根瘤菌属(Azorhizobiumspp.)和百脉根根瘤菌(Rhizobiumloti)的结瘤基因均在染色体上。所有的根瘤菌都存在共同结瘤基因(common nodulation genes，Nod A，B，C)，基因Nod D也普遍存在于所有根瘤菌中，且是唯一一种能在缺乏相应寄主时表达的结瘤基因。

根瘤菌的共同结瘤基因和寄主特异性结瘤基因的表达控制着根瘤的形成，这些结瘤基因大部分从植物和根瘤菌相遇就开始表达直到根瘤菌被释放入寄主细胞。

目前认为基因Nod D的产物能与相应的寄主植物分泌物特别是类黄酮(flavenoids)相互作用，诱导共同结瘤基因Nod ABC的表达，引起根瘤形成。类黄酮是一类复杂的酚类化合物，对细菌内膜有很高的亲和性，能插入内膜磷脂双分子层。

寄主特异性结瘤基因(host-specific nodulation genes)决定结瘤因子的寄主专一性。寄主特异性结瘤基因的差异取决于根瘤菌的种类，目前已在不同的根瘤菌中鉴定出50多种寄主特异性结瘤菌基因。结瘤因子(nod factors)，是主要的寄主专一性决定因子之一。目前已知结构特征的根瘤菌的结瘤因子至少有13种。结瘤因子是三到六聚的乙酰葡萄糖胺组成的寡糖，并受到多种修饰(如脂肪酰基化及磺基化)，很可能是根瘤原基形成和早期结瘤基因表达所需的唯一信号分子，是根瘤菌与寄主特异识别的主要信号。结瘤因子由Nod ABC和寄主特异性结瘤基因共同编码合成，Nod ABC编码合成结瘤因子的寡糖骨架，因此所有的根瘤菌的结瘤因子都具有相同的基础结构;寄主特异性结瘤基因负责添加修饰基团，为结瘤因子提供寄主专一性。大部分根瘤菌菌株不能产生单一的结瘤因子，但有相当多的根瘤菌菌群能产生具有不同结合特征的结瘤因子，这些结瘤因子能产生协同作用诱导结瘤反应。结瘤因子是决定根瘤菌特异性寄主的主要因素。

3.根瘤的形态和功能

当根瘤菌从侵染线释放出时，细胞开始分裂，在感染后的1～2星期，可见的根瘤开始出现。根据结构特点，豆科植物根瘤可以分为有限型根瘤(determinate nodules)和无限型根瘤(indeterminate nodules)。有限型根瘤无分生组织，生长发育一段时间后，各部分同时分化成熟，根瘤体积不再增大。这类根瘤外形一般为球形，如大豆根瘤。无限型根瘤具有顶端分生组织，在根瘤成熟后仍可继续生长，使根瘤体积增大，甚至可以分叉。这类根瘤的外形多为圆柱形、囊状、鸡冠状，如豌豆、三叶草和苜蓿等植物的根瘤。无论是哪种根瘤，固氮作用都开始在根瘤形成大约15天后。

固氮是固氮菌和植物共同作用的结果。一般条件下，根瘤菌尽管能生长繁殖，但不能固氮，只有进入宿主植物根，宿主提供固氮所需的条件，才能固氮。在纯培养时，根瘤菌只能在严格控制的微好氧条件下才具有固氮能力。这是因为，根瘤菌需要氧为固氮作用产能，而固氮酶对氧敏感，在氧压较高时又容易失活。在根瘤中，植物不但向真菌不断提供低浓度、高流量的自由O₂，且O₂浓度的精确水平由能与O₂结合的豆血红蛋白(leghemoglobin，Lb)控制，Lb在氧化态(Fe³⁺)和还原态(Fe²⁺)之间循环起着调节氧的缓冲剂的作用，解决了类菌体固氮需氧与不需氧的矛盾，使呼吸作用和固氮作用能协调地进行。然而，植物不能独立地合成Lb，植物合成Lb，需要与根瘤菌共同作用的诱导。

根瘤固氮的产物并不为根瘤菌自身同化所利用，绝大部分通过类菌体周膜分泌到植物细胞浆中，在那里被同化为酰胺态或酰脲态简单化合物，然后转运到植物其他部分中去利用。无限型根瘤的固氮产物为NH₃，并最终以天冬酰胺的形式运输到植物的嫩枝。有限型根瘤的固氮产物NH₃，最终以嘌呤的形式运输到植物嫩枝。

根瘤共生固氮在遗传上也是根瘤菌和宿主植物共同作用的结果。一般根瘤菌具有固氮作用的全部遗传因子，而感染性(结瘤作用)是由根瘤菌和豆科植物共同决定的。植物基因控制能否结瘤或形成无效根瘤，根瘤菌带有决定感染性和专一性的基因。豆血红蛋白中血红素部分由根瘤菌的基因决定，而蛋白部分由植物基因决定。

根瘤共生固氮量取决于植物品种和根瘤菌菌种。同时根瘤共生固氮也受包括土壤湿度、土壤中氧气含量、温度、土壤酸度、化合态氮素、矿质营养等环境因子的影响。