生物强化的概念与机理机理

一、生物强化

1.生物强化的概念与作用机理

生物强化，又称生物增强，是通过向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物来增强生物量，以强化生物对某一特定环境或特殊污染物的反应，提高废水处理系统的处理能力，从而达到去除某一种或某一类有害物质的目的一种生物技术。

生物强化技术中投加的微生物可以是从自然界中筛选的优势菌种，来源于原有处理体系或其他自然环境，经过驯化、富集、筛选、培养，从而达到一定数量的微生物，也可以是原来不存在的外源微生物甚至是通过遗传工程技术产生的高效菌种。所投加的微生物应满足三个基本条件:①投加后，菌体活性高;②菌体可快速降解目标污染物;③在系统中不仅能竞争生存，而且可维持相当数量。

2.生物强化的作用机理

生物强化是通过向自然菌群中投加具有特殊作用的微生物来增强生物量，以强化系统对某一特定环境或特殊污染物的反应。生物强化的作用机制主要是投加的高效微生物直接作用和微生物的共代谢作用。

(1)直接作用

直接作用是指投加的高效微生物直接以目标降解物质为主要碳源和能源，使之分解转化，从而加强生物处理系统对目标污染物质的去除能力。首先将通过筛选、驯化、诱变、基因重组等技术得到的微生物(高效微生物)，经培养增殖后投入处理系统。当原处理系统中没有这种微生物时，投加的高效微生物可有针对性地去除目标降解物，如原处理系统中只有少量这种微生物时，投加高效微生物可大大缩短驯化微生物所需时间，提高去除能力。

(2)共代谢作用

微生物的共代谢作用是指只有在有初级能源物质存在时，才能进行的有机化合物的生物降解过程。对于一些有毒有害物质，微生物不能以其作为碳源和能源生长，但在其他基质存在下能够使原本不能利用的这些物质得到降解。对于一些难降解的有机物如三氯乙烯(TCE)，以甲烷、芳香烃、氨、异戊二烯和丙烯为主要基质生长的细菌并不能将其作为碳源和能源，但在利用这些原始底物(初级基质，或共代谢基质)的代谢过程中，可以产生一种氧化酶共代谢三氯乙烯(TCE);Acenetbacter sp.的菌株生长在含有4-氯苯甲酸盐的基质上时，可以使原本不能利用的3，4-2氯苯甲酸盐得以转化。

许多难降解有机物的去除都是通过共代谢作用实现的。如在焦化废水的处理中，投加生活污水能大大提高COD去除率，原因主要是生活污水中含有大量营养物质，加强了微生物的共代谢作用。

共代谢能提高微生物对某些难降解有机物的去除效果，但机理十分复杂。微生物的共代谢包括:以易降解的有机物为碳源和能源，提高共代谢菌的生理活性;以目标污染物的降解产物作为酶的诱导物，促进酶的合成;不同微生物之间的协同作用等。

3.生物强化的技术路线

生物强化过程的实现大致包括菌种的分离筛选、驯化、培养及应用。

首先是选择分离源。分离源所处的环境应有利于目标微生物的生长、存在较大数量。其次根据目标微生物对环境因子的要求设定选择培养条件，驯化和培养目标微生物，最后将目标微生物投加到生物处理系统中。

诱变育种是最常用的微生物驯化方法，主要是通过诱变剂处理，使微生物发生变异。诱变处理首先是将细菌经过功能筛选，挑选优良的出发菌种;再将细菌菌株经紫外线、亚硝酸、偶氮氨基氧化嘌呤或其他诱变剂处理，使基因突变;然后从经处理的菌株中筛选具有所需特性且能在特定废水中存活的变异菌株。筛选是在单一碳源培养基上连续进行，诱变剂量递增以强化菌株特性，也可人为地提供特殊的强化环境来加速筛选过程。最后将筛选出的变异菌株在实验室及现场进行应用试验，测试项目包括安全性、稳定性及菌株繁殖能力等。

4.直接投加生物强化技术——直接投加特效降解微生物

生物强化技术主要包括直接投加生物强化技术和固定化生物强化技术，而直接投加生物强化技术又可分为直接投加特效降解微生物和直接投加共代谢基质类物质两大类。

(1)直接投加特效降解微生物

生物强化技术应用最为普遍的方式是直接投加对目标污染物具有特效降解能力的微生物，将这些特效微生物经过筛选、培养、驯化之后，投入到污染环境中。投加微生物以目标污染物为唯一碳源和能源，投加的微生物可以附着在载体上，形成高效生物膜，也可以游离状态存在，可以利用现成的生物强化制剂，有些甚至是借助专门的反应器来完成的。

生物强化制剂是将从自然界中筛选出来的、有特定降解功能的微生物制成菌液制剂或将其附着在麦麸等载体上制成干粉制剂。液态菌液微生物一般成活率较高，固态制剂使用前需用水溶成液态，细菌的成活率较液态菌液低，但更方便运输和存储。生物强化制剂具有很多优点:缩短微生物培养驯化的时间，迅速提高生物处理系统中微生物的浓度，从而提高工作效率;使用安全，操作简单方便，可以实时地处理污染。例如在处理下水道的油脂堵塞时，只需将细菌激活后加入到下水管道中，微生物很快在新的环境中占主导地位，开始侵蚀油脂类的有机颗粒，使管道中的阻塞物油脂块脱落下来。

生物强化制剂的生产和使用主要步骤为:

①从自然环境中筛选、分离、纯化特效微生物或通过遗传工程手段获取特效微生物;

②扩大培养;

③制成液体或干粉活菌制剂:将具有特定降解功能的微生物制成菌液制剂或将其附着在麦麸上制成干粉制剂;

④向生物处理系统投加。一般在投加前需先将微生物激活。

目前，直接投加高效微生物生物强化技术已成功地应用于难降解废水处理、有机垃圾、污泥堆肥处理以及污染土壤的生物修复等方面，大大提高了有机物降解转化速度和处理效果。

如在纸浆和造纸废水中含有树脂酸，对水生生物具有毒性。直接投加特效降解微生物——树脂酸降解菌大大提高了对树脂酸的去除率。

焦化废水是成分极其复杂的难处理废水，含有酚类、其他单环及多环的芳香族化合物及含氮、硫、氧的杂环化合物。对焦化废水中特殊污染成分的降解最有效的是投加特效微生物，如苯酚降解菌、萘降解菌和吡啶降解菌等，可以降解废水中的特殊污染物，投加苯酚降解菌Pseudomonas protida ATCC11172可使苯酚的去除率一直保持在95%～100%，而没有进行生物强化的对照组，苯酚的去除率开始很高，但很快降到40%左右。

印染废水中含有大量难降解的有机染料，使用传统生物处理技术对印染废水色度的去除效果很不理想，通过投加特效优势菌，可取得较好脱色效果，并能保持处理效果的稳定性。如一嗜热鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium thalpopilum)菌株在5天内对派拉丁蓝的脱色率就达到34%。目前，投菌法对16偶氮染料、蒽醌染料的脱色处理方面都有良好效果，系统脱色率可稳定在90%以上。常用的脱色优势菌有假单胞菌、气单胞菌和红螺菌等，可从废水处理污泥中筛选、分离、驯化，也可以是遗传工程菌，实践中也可使用混合特效菌群，脱色效果有时比纯菌株好。

投加高效复合微生物菌群可以使堆层中的微生物迅速繁殖，并维持在相对稳定的较高水平上，加速生活垃圾和污泥的降解。利用生活垃圾和污泥作为原材料，接种高效复合微生物菌群进行堆肥，是固体废物资源化的一条有效途径。

直接投加生物强化技术同时也是生物修复的重要手段，常用于污染水体、污染土壤的原位生物修复中。投加的微生物大多使用土著微生物，一方面是由于土著微生物降解污染物的巨大潜力，另一方面是接种的微生物在环境中难以保持较高的活性;此外因工程菌的生态安全性等原因，使其在工程应用中受到了严格的限制。当受污染环境中合适的土著微生物生长过慢，代谢活性不高，或者由于污染物毒性过高造成微生物数量反而下降时，可以人为地接入外源的适宜的污染降解高效菌，同时提供这些微生物生长所需的营养。

构建外源和土著微生物的耦合系统往往比简单投加单一菌种更有效。张甲耀等以三环芳烃蒽为模式污染物，根系发达的经济作物黄麻为模式植物，把蒽高效降解菌和生物表面活性剂产生菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugiosa)作为根际微生物耦合系统的构建菌，与黄麻根际优势菌进行原生质体电融合，形成既产生表面活性剂和对蒽具有高效降解能力且能在根际旺盛生长的耦合系统，将所得到的融合子定殖回黄麻根际，可高效修复蒽污染土壤。

(2)投加生物共代谢基质及辅助营养物质

实践中可利用生物的共代谢作用来强化生物处理。由于许多难降解有机污染物的降解是通过共代谢途径实现的，且在常规生物处理系统中能降解这些目标污染物的微生物活性低、数量少，因此，在反应体系中投加碳源、能源营养物质，或目标污染物降解过程中所需的因子，将有助于降解微生物的生长。基质类似物(诱导物)是目标污染物的降解产物、前体，可以作为酶的诱导物，提高酶的活性。

投加共代谢初级基质能强化系统对难降解污染物质的处理能力。在投加初级基质的情况下，微生物可以利用初级基质为碳源和能源，同时氧化原来不能利用的二级基质，从而改善处理系统的性能。对于一些难降解的有机污染物(二级基质)，微生物并不以其为碳源，而以甲烷、丙烷、甲苯、酚、氨和二氯苯氧基乙酸等为原始底物(初级基质)，但微生物在利用这些初级基质作为碳源的过程中，能产生一些化学物质等改变了目标污染物的结构，使得原本不能利用的二级基质能被微生物降解。

微生物以其他底物为碳源，形成可以改变目标污染物结构的氧化酶，需要Fe³⁺或Mg²⁺来传递电子，在废水中加入这些离子可以提高污染物的降解速率。

投加电子受体和辅助营养物质，如微生物生长所需的微量元素、维生素、有机酸等成分，也有助于提高系统的处理能力。

有时也同时使用高效菌种和共代谢初级基质组合协同作用来强化处理系统。有人研究了生物共代谢对焦化废水生物处理的增强作用，同时研究了高效菌种和共代谢初级基质组合协同作用的效果。结果表明，投加共代谢初期基质、Fe³⁺和高效菌种，均能促进难降解有机物的降解，提高焦化废水COD去除率，当三者协同作用时，效果更好。

5.固定化生物强化技术

直接投菌法虽然简单易行，但是所投加的特效微生物容易流失，或易被其他微生物吞噬。固定化技术是将单一或混合的优势菌株固定封闭在特定的载体上，例如将特定的微生物封闭在高分子网络载体内，使菌体脱落少、活性高，从而提高优势微生物浓度，延长其在生物处理器中的存留时间。

固定化生物强化(主要是固定化酶、固定化微生物)技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术。该技术利用物理或化学的手段将游离微生物细胞或酶定位于限定的空间区域，并使其保持活性反复利用，具有效率高、稳定性强、反应易控制、对环境耐受能力强、保持菌种高效等优点。目前，固定化生物强化技术已由原来的单一固定化酶、固定化微生物细胞发展到联合固定化(co-immobilization)，如酶与微生物细胞、好氧微生物与厌氧微生物的联合固定。

(1)常用的固定化方法

常用的微生物固定化方法主要有:包埋法、交联法、载体结合法、系统截留法。

固定化细胞载体主要分两类:①天然高分子凝胶载体，常用的是琼脂、海藻酸钙等;②有机合成高分子凝胶载体，如聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(PAM)等。高效的固定化细胞载体应满足以下条件:①传质性能好，废水较容易接触包埋在其中的微生物;②强度好，不易破碎;③对微生物没有毒害作用;④性质稳定，不易被生物分解，寿命长且价格低。

1)包埋法。包埋法操作简单，对细胞活性影响小，固定化细胞强度高，是应用最广泛的固定化方法。包埋法是利用线性网状结构的高分子聚合物载体的包裹作用，将游离细胞载留在高分子材料内，其结构可防止细胞渗出到周围培养基中，但底物仍能渗入与细胞发生反应。

常用的包埋法有悬滴成球法及冷冻法。常用的包埋载体有琼脂、海藻酸钙等天然高分子凝胶及聚乙烯醇(PVA)、聚丙烯酰胺(ACAM)等有机合成高分子凝胶。包埋法操作简单，对细胞活性影响小，但目前包埋的固定化细胞使用寿命不长，从而限制了它的工业化应用。

包埋优势菌比游离优势菌降解效率高。包埋对高效微生物提供了临时保护的作用，防止被其他微生物如原生动物捕食，同时帮助外来细菌黏附在絮凝体中，提高了高效菌的降解速率，同时可提高处理效率和耐温冲击性，同时微生物活力及稳定性均保持较好。

2)交联法。交联法又称无载体固定化法。该法不用载体，微生物细胞直接与两个以上官能团的试剂进行交联反应固定，试剂的官能团以共价键方式为细胞之间架桥，形成三维网络状絮体。由于酶蛋白的官能团参与此反应，所以酶的活性中心结构可能受到影响而使酶显著失活。此外，交联剂如戊二醛等价格昂贵，限制了其应用。

3)载体结合法。又称吸附法，通过物理吸附、离子结合、共价结合及生物特异吸附等作用将生物催化剂(酶)固定在不溶性载体上。这种方法操作简单，对微生物活性影响小，但所结合的微生物量有限，反应稳定性和反复使用性差。美国宾州大学培养从活性污泥中分离出的优势菌丝孢酵母(Frichosporon cutaneum)和假单胞菌(Pseudomona sp)，提取高酶活性的酚氧化酶，再以化学手段结合到玻璃珠上，用于处理冶金工业含酚废水，使固定酶活性可达游离细胞的90%。

4)系统截留法。该方法利用各种半透膜(如渗析膜、超滤膜、反渗透膜、中空纤维等)将生物催化剂限定在一定的空间范围内，或将过滤、离心、沉淀后的生物催化剂返回到生物反应器中循环使用。其中，中空纤维膜(hollow fiber membrane)生化反应器最有实用价值。

(2)固定化技术在实践中的应用

固定化生物强化技术能大大提高难降解物质的处理效率，目前已成功地应用于废水、废气处理等方面，如固定化脱色菌群处理印染废水可提高印染废水脱色率;化工、焦化废水中的酚、氰等有毒化学物质，用固定化微生物方法处理具有耐毒性且处理效率高;将硝化细菌和反硝化细菌分别包埋，用于废水脱氮可提高脱氮效率。用固定化酶和固定化微生物处理废气中的恶臭含硫污染物和挥发性有机污染物均取得了可喜成果。

废水处理实践中，由于废水组成复杂而且经常变化，利用单一的固定化酶很难收到好的处理效果，只有利用多种固定化酶组合处理，才能使有机物完全无机化和稳定化。微生物本身就是多酶体系的载体，如果把对多种污染物降解能力强的多种微生物固定在同一载体上，无疑会大大提高处理效率。

虽然固定化酶与固定化微生物在处理效果上有明显的优越性，但由于这种技术处理废水成本高，且固定化酶活性半衰期为20天，使用寿命较短，机械强度也较差，且酶柱和酶布上易长杂菌，这些都制约着固定化酶和固定化微生物这一新技术的推广和应用。基于上述原因，固定化酶和固定化微生物技术可以在小水量的特种工业废水中应用。

值得注意的是，并非所有固定化的微生物都优越于游离态的微生物。固定化微生物受其自身传质性能和传氧性能的影响，特效微生物和目标污染物的接触受到阻碍，从而影响污染物的降解效率。而游离态的混合菌液投加到反应器中之后，能迅速得到混合、扩散、分布，没有传质阻力。