铬的微生物转化

七、铬的微生物转化

铬可以多种氧化态形式存在，但最稳定、最常见的形式是三价(氢氧化物或硫酸盐)和六价(CrO₄^2－或Cr₂O₇^2－)的形式。Cr是地球上第七种丰富元素，而在地壳岩石中排第21位。Cr在地壳中的丰富度范围从100到300μg/g。土壤含量5～3000μg/g，淡水的Cr浓度从0.1～0.5ppm，海水的含量浓度范围在0.0016～0.05ppm之间变化。世界上的Cr的产量在10⁷吨/年，60%～70%用于合金、电镀，铬的广泛使用已使Cr成为空气、土壤和水体的污染物。在造纸厂排出的污水中浓度水平达到80ppm。

1.微生物对铬的吸收和积累

铬主要以氧离子形式(即CrO₄^2－)存在，微生物对铬的吸收是依赖于能量、通过硫酸盐迁移系统的主动吸收过程。这种吸收过程已在鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌以及真养产碱菌中得到证明。铬的这种氧离子形式不被细菌外被的阴离子化合物所截留，而对于阳离子(Cr(Ⅲ))衍生物则易结合到沙门氏菌、芽孢杆菌等微生物的外被脂多糖多聚物中。

酵母菌吸收Cr(Ⅵ)则是通过一种非特异性阳离子载体透性酶系统，这种系统也可以迁移硫酸盐、磷酸盐等不同的阴离子。某些镉酸盐抗性突变株(粗糙脉孢菌)就具有还原硫酸盐转化特性，并且已经证明Cr(Ⅵ)毒性是由于对硫酸盐吸收的特异性抗性，而Cr(Ⅲ)毒性则来源于对铁迁移的抗性。

2.铬的生物毒性

铬的生物毒性很大程度上取决于它的氧化态，一般Cr(Ⅵ)对大部分生物都是高毒性的，而Cr(III)则相应低毒。有研究报道藻类(Scenedesmus和Selenastrum)在100ppm Cr(Ⅲ)时生长，而同样浓度的Cr(Ⅵ)不能生长。Cr(Ⅵ)还原到较低氧化态过程和毒性联系在一起，这主要是这个过程会产生自由基。Cr(Ⅴ)的短暂形成也是产生毒性的原因，Cr(Ⅴ)复合物源于生理还原剂(如NAD(p)H，FADH以及几种戊糖和谷胱甘肽)对Cr(Ⅵ)的还原。这些复合物和H₂O₂反应产生大量的·OH基，而又不同时产生O^2－。·OH可以直接触发DNA改变以及其他的毒性效应。

3.铬的转化与抗性

微生物对铬的转化常和抗铬能力联系在一起。Cr(Ⅵ)能被还原成较低毒性的Cr(Ⅲ)。这个过程可以受到质粒与染色体的调控。具有铬酸盐抗性的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)Hol就是被彻底研究的Cr(Ⅵ)还原细菌。从铬污染区分离出来的菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.)QCl-2也能耐受铬酸盐和把Cr(Ⅵ)还原成Cr(Ⅲ)。普通脱硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)的Cr(Ⅵ)还原活性位于细胞的溶解胞质和膜上，细胞色素C₃能催化Cr(Ⅵ)和铀［U(Ⅵ)］的还原，具有Cr(Ⅵ)和U(Ⅵ)还原酶的功能。

细菌对铬的抗性从遗传上说是由质粒和染色体决定的。Dhakephalker等报告门多萨假单胞菌(P.mendocina)携带的质粒pAR1180决定其铬抗性和还原。与质粒pVM505(源于铜绿假单胞菌)和pMOL28(源于真养产碱菌)相关的铬抗性决定子已被从分子水平上进行分析。铬抗性chrA基因已被克隆和测序。其编码的铬抗性疏水性蛋白称为ChrA，测序表明其分别由416个和401个氨基酸残基组成。两种ChrA多肽有29%的相同残基。来源于假单胞菌和产碱菌的chrA可以在大肠杆菌中表达，但不使宿主具有铬抗性。在产碱菌中还发现第二种基因决定子ChrB，而这并不存在于假单胞菌中，并且其在诱导铬抗性表型中有协助作用。

ChrA蛋白被深入研究，根据氨基酸组成和亲水特点，来源于上述假单胞菌和产碱菌的这种蛋白被认为是一种膜蛋白，有12个跨膜翼(transmembrane spans)。ChrA蛋白同系物也从蛋白质序列数据库中发现，这包括来源于蓝细菌和古菌的蛋白(表11-7)。Srpc蛋白是源于蓝细菌(cyanobactererium)、聚球藻属(Synechococcus)质粒的硫调控蛋白，和硫酸盐迁移有关。X^※是单细胞藻类集胞藻(Synechocystis sp.Strain pcc6803)表达的蛋白片段。MJ0718是产甲烷古生菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)表达的蛋白片段。而ArsB是砷抗性操纵子的内膜蛋白，其在几种细菌中能排出砷酸盐，ArsB也有12个跨膜片段。

利用外翻的膜囊(everted membrane vesicles)研究证明由ChrA(P.aerccginosa)主导的铬酸盐抗性的基础是一种排出系统，把胞质中的铬酸盐排出。抗性菌株中的胞囊比敏感菌株积累更多的铬酸盐。铬积累符合Michaelis-Menten动力学，Km为0.12mmol/L铬酸盐，有意思的是这个Km值和通过ArsB排出砷酸盐的值(Km:0.14mmol/L)十分接近。研究也证明铬酸盐排出依赖于NADH的加入，这个过程受呼吸链抑制剂和解耦联剂的损害，这说明铬酸盐排出依赖于膜的潜能。通过膜囊的铬排出也受到硫酸盐抑制，说明ChrA结合到硫酸盐上。

表11-7　　ChrA蛋白同系物的相似性

a.与chrA蛋白(P.aeruginosa)相比较。

b.E.coli质粒R773砷抗性操纵子的膜蛋白。

但也有研究证明质粒赋予的铬抗性和硫酸盐转移不相关，有研究表明铬抗性菌株和敏感菌株有同样的硫酸盐迁移动力学，还有的研究报告质粒(P.flourescene的质粒pPLHB1)所产生的抗性不依赖于Cr(Ⅵ)的还原。

4.铬污染的生物修复

由于铬在工业领域有巨大经济价值而大量使用，铬是环境中的重要的金属污染物。由此可知铬污染环境的生物修复是十分重要的。铬污染的生物修复主要建立在减毒和和去除的基础上，因此Cr(Ⅵ)的还原减毒以及铭化合物(包括Cr(Ⅲ)等低毒的化合物)的去除是生物修复的基本过程。

生物修复的基本方法包括:①利用某些细菌的还原能力把高毒的Cr(Ⅵ)还原成低价低毒Cr(Ⅲ);②胞外多聚物与Cr结合形成低毒不溶性的金属复合物。还原Cr(Ⅵ)的细菌受到广泛的关注，其使用条件正在明确(表11-8)，这使得利用这些细菌作为生物技术工具修复铬酸盐污染地区具有可能性。利用细菌生物修复的优势是不需要高能量投入和使用有毒的化学试剂，而只需利用自然、非有害的菌株。一些厌氧的梭菌和硫酸盐还原菌能在胞外沉积铬，形成不溶有性的金属复合物，复合物的毒性低于离子形式铬，这也是一条修复途径。

表11-8　　Cr(Ⅵ)还原菌的特征

ND:未测定

细菌重金属抗性基因的工程化已经产生出有毒金属生物传感器，由chr铬酸盐抗性基因和lux报告基因转录融合子构成铬生物传感器。融合子(表达于真养产碱菌)可对微摩尔浓度的铬酸盐和重铬酸盐离子作出反应，但对Cr(Ⅲ)化合物的敏感性要低十倍，这种情况下，用其他氧离子没有观察信号，这种生物传感器可以用来监测工业污水中的铬酸盐水平。

真菌生物修复铬污染环境也备受重视。主要的方面包括:①真菌细胞壁和多羧化载铁体结合金属离子。真菌细胞壁组分中的几丁质(N-乙酰葡萄糖胺的同质多聚物)和壳聚糖(N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖胺的异质多聚物)的脱乙酰氨基可以作为结合金属的位点。多羧化载铁体能结合Fe(Ⅲ)、Cr(Ⅲ)和Al(Ⅲ)，并可积累在细胞内。②真菌生物量作为吸附Cr的生物吸附剂。大毛霉(Mucor mucedo)、Rhizomucor miehei、Rhizomucor arrhizu、热带假丝酵母(Candida tropicalis)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)的生物量是理想的Cr生物吸附剂。③铬［Cr(Ⅵ)］抗性真菌用于Cr污染环境修复。许多从Cr污染环境中分离出来的曲霉(Aspergillus spp.)和假丝酵母(Candida spp.)的铬酸盐抗性菌株已被证明有Cr(Ⅵ)还原活性。研究表明假丝酵母在培养于铬污染土壤时能减少40%的Cr(Ⅵ)。