环境污染的指示微生物

环境污染的指示微生物_环境微生物学（下

一、环境污染的指示微生物

某些微生物种类的存在和消失可以作为监测指标。指示微生物(indicator microorganism)是指用以指示和评价环境样品污染程度和性质的代表性微生物。

1.一般污染的指示微生物

环境中一般性污染主要是指糖、脂、含氮有机物、有机酸等天然有机物和硫、磷等无机物引起的化学性污染，以及细菌、真菌、病毒等在内的生物性污染。指示微生物可以反映出常见有机物和微生物的一般性污染状况。

(1)异养细菌总数

细菌总数不但反映了环境中细菌的污染程度，以有机物作为碳源和能源的好氧和兼性厌氧菌的数量可以指示环境一般营养性有机物的污染程度，故通常用异养细菌总数作环境监测指标。常用测定方法为异养平板计数(heterotrophic plate count，HPC)，即将一定稀释倍数的样品悬液定量接种于营养琼脂培养基平板上，在有氧条件下，37℃培养48小时计数所得的菌落生长结果。HPC常用于水质标准。饮用水中，HPC应不超过每毫升100个。

(2)霉菌和酵母菌总数

霉菌和酵母菌都是异养性微生物，有些有致病性或产毒素。霉菌和酵母菌总数是指环境中的被测样品经过处理后，在一定条件下培养所得的单位被测样品(1g或1ml)中所含的霉菌和酵母菌菌落数。霉菌和酵母菌在环境中普遍存在，它们营养源广泛，与细菌相比，它们一般更喜好偏酸性的好氧环境，加上霉菌孢子散布广，存活力强，更能耐受不良环境，故霉菌和酵母菌总数可从另一角度反映环境的一般性污染。目前在食品、药品和化妆品中都规定有检出标准。

2.粪便污染指示微生物

肠道病原菌对水体的污染是引起霍乱、伤寒等流行性疾病的主要原因，而环境中的肠道病原菌主要来自人畜粪便。由于肠道病原菌在环境中存在的数量少，检测困难，因此，一般的常规检测方法不是直接检测病原菌，而是检测和病原菌并存于肠道且具有相关性的“指示菌”，以间接指示肠道病原菌存在的可能性，并从这些“指示菌”的数量来判断水质污染程度和饮用水的安全性。

指示菌评估粪便污染程度的依据是，所有温血动物的粪便中都存在某些非病原体细菌，这些细菌数量大，可以用简单的细菌学方法方便地分离和测定，在水中检测到这些细菌意味着已经发生粪便污染，水中也可能存在肠道病原体。

作为一种理想的粪便污染指示生物，须满足如下标准:该生物应是温血动物肠道微生物群落的组分;该生物在体外存活时间应比生命力最强的肠道病原体长;不管肠道病原体是否存在，该生物都应该存在;该生物的密度应与粪便污染程度具有直接关系;该生物在水体中不能繁殖;该生物适用于各种类型的水体;最后，其检测方法还要简单易行。

目前，水体污染常用的指示微生物主要有大肠菌群、粪大肠菌、粪链球菌、产气荚膜梭菌、噬菌体和总异养细菌等。

(1)总大肠菌群

总大肠菌群是最基本的粪便污染指示菌，也是最常用的水质指标之一。美国1914年起就采用大肠菌群作为饮用水粪便污染的指示生物。现在很多国家都采用大肠菌群作为评估饮用水、娱乐性洗浴水、废水排放以及各种食物的官方标准(表13-1，表13-2)。

大肠菌群(coliform bacteria)存在于所有温血动物的肠道中，随粪便被大量排出，包括埃希氏菌、柠檬酸杆菌、肠杆菌和克雷伯氏菌等。在被污染的水中，大肠菌群的浓度大致与粪便污染的程度成正比。由于大肠菌群的生命力通常比一些致病菌强，因此，水中不含大肠菌群就表明在细菌学上人使用是安全的。相反，如果水中存在大肠菌群则意味着其他可能致病的微生物也可能存在，这样的水作为饮用水就存在安全隐患。通过经验得知，100ml饮用水中不存在此类微生物就可以确保不会爆发细菌性水传播疾病。

大肠菌群相对容易检测。大肠菌群包括了所有好氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在乳糖蛋白胨培养基中摄氏35度培养48小时会发酵乳糖产气。

表13-1　　欧盟的饮用水规范

大肠菌群常用的测定方法有发酵法与滤膜法两类。三种方法常用于鉴别水中的大肠菌群:最可能数目试验(most probable number test MPN)、有或无试验(presence-absence test P-A)以及滤膜试验(membrane filter test MF)。

表13-2　　美国联邦政府和州政府的微生物标准

1)发酵法亦称多管发酵法或三步发酵法、最可能数目试验。MPN试验用于检测样品中大肠菌群的存在并估计其数量。MPN试验包括三个步骤:推测试验、确证试验和完成试验。

①初发酵(又称推测实验)系将一系列不同稀释度待检测水样分别接种入含有乳糖等糖类之培养液中，经37℃培养24小时，观察产酸产气情况以初步判别是否有大肠菌群存在。

②平皿分离(确证试验)由于水中除大肠菌群外，尚有其他细菌亦可引起糖类发酵，故需进一步证实。主要是通过将少量从初发酵阳性试管中取出的菌种接种在选择性细菌培养琼脂如伊红美蓝(EMB)琼脂或远藤氏琼脂上培养，以证实大肠菌群的存在。这类培养基可以抑制其他细菌而利于大肠菌群生长。如培养基上出现绿色光泽或中心颜色较暗的菌落，就表明存在乳糖发酵细菌。根据菌落特征，挑出可能为大肠菌群的菌落制片，如经镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，即可进一步证明为大肠菌群。

③复发酵(完成试验):有些情况下需做完试验(completed test)，即将琼脂培养基上的菌落重新接种到乳糖培养液中，经24小时产酸产气者即最后确证为有大肠菌群存在。

根据肯定有大肠菌群存在的初发酵阳性试管数目以及实验所用水样，利用数理统计原理或查阅专用统计表，最后估算出每升原始水样中大肠菌群的最可能数目(MPN)。

2)滤膜试验(membrance filtration test，MF)。上述发酵法全部检测需时较长。为了缩短时间，可用滤膜法，有可能在24小时左右完成。滤膜法同样可确定样品中的大肠菌群数量，但MF法所需试验试管更少，工作量更小，操作更简便。

该法是将一定量的水(饮用水通常为100ml)通过滤膜(孔径为0.45μm)过滤，滤膜将细菌截留在其表面。然后将滤膜放在用特殊培养基(如改良的远藤氏培养基)饱和的薄吸收垫衬上，该培养基可选择性地使目的生物生长。滤膜在35℃下培养18～24小时。计数具绿色光泽的菌落，就可确定水样中大肠菌群的数量。

主要步骤如下:

①水样过滤:选用具有微孔的滤膜，通过抽滤一定水量，将水中细菌截留在滤膜上。

②培养:将滤膜不截留细菌的一面贴附在特定固体培养基上(例如伊红美蓝培养基)进行培养。

③观察结果:通过菌落特征及镜检菌体形态初步确定大肠菌群细菌;凡革兰氏阴性无芽孢杆菌再接种入含乳糖培养基中产气者可确证为大肠菌菌群;最后根据通过水量及滤膜上长出的确证为大肠菌的菌落数换算出每升水中大肠菌群数。

3)有或无(presence-absence，P-A)试验。有或无试验(P-A试验)不是定量试验，而是确定样品中是否存在目标生物大肠菌群的定性试验。P-A试验中使用单个如MPN试验中所用的含乳糖培养基的试管，但不稀释。

虽然滤膜法比发酵法省时间，但仍不能及时指导生产。当发现水质有问题时，这种不符合标准的水已进入管网一段时间了。此外，当水样中悬浮物较多时，亦会影响操作及大肠菌群发育，使测定结果不准确。

近年来，酶检测法得到了发展，可同步检测饮用水中总大肠菌群和大肠埃希氏菌。检测可以是简单的P-A试验或MPN试验。如近年来常用的Colilert试验就是将样品加入含有由盐或特异酶基质组成的粉末状物质的单个试验瓶(P-A试验)或MPN测试管中，以盐或特异酶基质作为目标生物的唯一碳源。培养24小时后，存在总大肠菌群的阳性样品变黄，大肠埃希氏菌阳性样品在黑暗中用长波紫外光照射会发荧光。

大肠菌群作为反映水样的卫生质量和污染程度的指标，在评价水的细菌学质量上的优点是毋庸置疑的。但大肠菌群作为指示生物仍有不足之处，如对一些消毒剂的抵抗力不及肠道病毒和原生动物病原体强，存活时间也较它们短，检验大肠菌群结果为阴性的水样仍可以对人体健康产生危害，这就限制了大肠菌群指示生物的作用。此外，由于水中大量的异养菌可能会掩盖大肠菌群在用于分离的选择性培养基上的生长，故大肠菌群的真实数量可能被低估。还有，所有大肠菌群的成员在天然地表水和饮用水配水系统中都会再生。即使在有游离氯存在时，大肠菌群也可在配水系统管道上的生物膜中集群和生长。大肠菌群在配水系统中的再生和恢复，就可能造成粪便污染的假象。

(2)粪大肠菌(Fecal coliforms)

总大肠菌群的许多种类并不仅仅来自于粪便。因此，后来又发展出一些方法，可只计数粪源性的大肠菌群，也即粪大肠菌(fecal coliforms)。粪大肠菌包括埃希氏菌属和克雷伯氏菌属，根据它们具有在44.5℃下培养24小时能发酵乳糖产酸产气的能力，而在实验室中被鉴别。

粪大肠菌可用类似检测大肠菌群的方法检测。分析水样时，MPN法使用EC营养肉汤培养基，膜滤法使用m-FC培养基。Colilert试验可在24小时内同步检测大肠菌群和大肠埃希氏菌这一主要的粪大肠菌。

使用粪大肠菌也有总大肠菌群类似的一些局限，如在水体中再生以及对水处理的抵抗力较病毒和原生动物弱。大肠菌群和粪大肠菌在未经污染热带水体中的频繁出现，以及它们在肠道外具有相当长时间的存活能力，意味着这些生物可在热带水体中自然发生，这就需要开发出适应这类水体的新的指示生物。另外，该试验只能指示是否有粪大肠菌，但不能区分到底是人还是动物的粪便污染。

(3)粪链球菌(Fecal streptococci)

粪链球菌是革兰氏阳性Lancefield D群链球菌的一个类群。粪链球菌属于肠球菌属Enterococcus和链球菌属Streptococcus。肠球菌属中的包括所有能在6.5%NaCl、pH9.6和45℃生长的链球菌:Enterococcus avium，Ent.faecium，Ent.durans，Ent.facculis和Ent.gallinarium;链球菌属中仅仅Streptpcoccus bovis和S.equinus被认为是真正的粪链球菌，这两种链球菌主要在动物中占优势，而Ent.Faecalis和Ent.faecium则特异性地存在于人类消化道中。

膜滤法和MPN法都可用于分离粪链球菌。膜滤法使用粪链球菌琼脂培养基，37℃培养24小时。所有红色、栗色、粉红色菌落计数作为推测性粪链球菌数。分离菌落在胆汁七叶苷培养基上再培养，44℃18小时，以确证粪链球菌的存在。粪链球菌产生周围棕色或黑色的零散菌落。

如果粪大肠菌/粪链球菌(FC/FS)的比值为4或更大，就意味着污染源来自人类;相应地，比值小于0.7，则表明是动物性污染(表13-3)。然而，FC/FS比值的有效性还值得探究。并且，该比值仅仅对近期(24小时内)的粪便污染有效。

与大肠菌群和粪大肠菌相比，粪链球菌在水中几乎不繁殖，对环境压力和氯化的抵抗力比大肠菌群大，一般在环境中存活更久，故其作为指示生物更具优势。

表13-3　　FC/FS比值

肠球菌(Enterococci)已被提议作为娱乐洗浴者患胃肠炎风险的指示生物，同时也被提议作为环境中肠道病毒的指示生物。

(4)产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)

产气荚膜梭菌只来自粪便。这是一种还原亚硫酸盐的产芽孢厌氧菌，革兰氏阳性、杆状。其芽孢耐热性很强(75℃下存活15分钟)，在环境中存活时间长，对消毒剂有非常强的抵抗力。虽然其坚韧的芽孢限制了它用作指示生物，但它可以作为历史性污染的指示生物、耐受稍差的指示生物的示踪物、饮用水和废水处理过程中去除寄生原生动物或病毒的指示生物等。

其他的厌氧菌如双歧杆菌(Bifidobacterium)和拟杆菌(Bacteroides)也被提议作为指示生物。因为有些双歧杆菌主要与人相联系，它们就可用做区分人类污染和动物污染。然而，目前还没有较好的、更标准的方法来检测环境中所有的厌氧菌，以使在常规检测中监测到厌氧菌。

(5)噬菌体

噬菌体在水样中的出现意味着出现了有能力维持噬菌体繁殖的细菌。所以噬菌体也可作为粪便污染的指示生物。由于在很多水环境中噬菌体的结构、形态、大小和行为同一些肠道病毒非常相似，噬菌体也作为病毒污染的指示生物。噬菌体常被广泛地用于评价病毒对消毒剂的抵抗力、病毒在水和废水处理期间的死亡规律以及作为地表水和地下水的示踪物等。目前常用的是大肠杆菌和脆弱拟杆菌的噬菌体。

使用大肠杆菌噬菌体具有简单廉价快速的优点，在8～18小时内就可得到结果。常用的两组噬菌体是体细胞大肠杆菌噬菌体，它通过细胞壁受体感染大肠埃希氏菌宿主菌株。F⁺特异性RNA大肠杆菌噬菌体，它通过F⁺或性菌毛感染大肠埃希氏菌及其相关细菌菌株。

大肠杆菌噬菌体存在于人类消化道以外的栖息地中，故难以区分人类和动物污染。脆弱拟杆菌的噬菌体则可作为环境中人类病毒的指示生物。拟杆菌的种类是严格厌氧的且是人类粪便的主要成分，并且脆弱拟杆菌噬菌体在环境中的消亡速率与人类肠道病毒类似。所以，积极对抗这些生物的噬菌体就成了潜在的合适的病毒污染指示生物。脆弱拟杆菌噬菌体在环境中不能繁殖，不存在于天然栖息地中，而只来自人类，仅存在于有人类粪便污染的环境样品中，这种特性有助于区分动物污染和人类污染。

然而，由于它们的宿主是检测方法复杂而耗时的厌氧菌，这就限制了脆弱拟杆菌噬菌体用作常规指示生物。

3.其他指示微生物

许多其他微生物也可作为某些特定用途的指示生物，用于水环境、公共场所、食品、化妆品、药物等的卫生安全性检验中。

蛭弧菌(Bdellovibrio)是环境中的天然寄居菌，以对宿主菌的寄生和裂解存活，当水体受到粪便污染时，可供其寄生的宿主增加，蛭弧菌数量增加，因而对粪便污染也有一定的间接指示作用。由于蛭弧菌生长繁殖需要一定时间，其对污染的指示有一定的滞后期，加上其数量升高后可长时间维持较高水平，实践中可结合大肠菌群判断受粪便污染的时间或污染是否持续。例如，蛭弧菌数量低，大肠菌群数量高表示水体刚受到污染，反之则指示污染已有一段时间，两者数量都高，则表示水体受到持续污染。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(绿脓杆菌)可作为游泳池等洗浴用水以及药品、化妆品卫生指示菌。这一革兰氏阴性无芽孢杆菌是最常见的机会性病原体，具有显著的公共卫生学意义，常引起眼、耳、鼻、咽喉感染、毛囊炎、皮炎、尿道感染。但由于该种类在自然界中普遍存在并能在自然条件下繁殖(它甚至能在蒸馏水中生长)，不能指示粪便污染。

金黄色葡萄球菌、链球菌、破伤风梭菌、沙门氏菌、志贺氏菌等都是重要的卫生指示菌，是食品、化妆品、药品、游泳池水等的监测指标。

过去常用大肠菌群评估游泳池水的安全性。然而人们后来发现，污染通常不是粪源性的，因为人类在娱乐用水中活动(如在维护差的游泳池游泳)引起的感染，其感染部位主要是呼吸道、皮肤和眼睛，主要是由一种革兰氏阳性细菌——金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等引起的皮肤感染，而水是传播媒介。因此，金黄色葡萄球菌被提出作为娱乐用水卫生质量的附加指示生物。另外，酵母中的白假丝酵母也可作为洗浴用水的指示生物。