微生物产甲烷

二、微生物产甲烷

甲烷是天然气和沼气的主要成分，是一种重要的工业和民用燃料源。天然气气源是由古生物体衍生而成的，是一种不可再生的能源。近年发现在海底蕴藏着数量巨大的甲烷水合物，可望作为一种未来的新能源。沼气是有机物经微生物厌氧降解而产生的一种混合气体，因最初是在沼泽地(湿地)发现了这种气体，故称之为“沼气”。

1.产甲烷的微生物

有机物的厌氧降解过程十分复杂，涉及众多的微生物种群。微生物种群之间通过直接或间接的共营养关系，相互影响和制约，形成一个微生态系统。根据厌氧降解过程的不同阶段，可将参与的细菌划分为四个主要菌群:①水解酸化菌群;②产氢产乙酸菌群;③同型产乙酸菌群;④产甲烷菌群。

(1)水解酸化菌群

水解酸化细菌主要是专性厌氧菌和兼性异养菌，其优势种属随环境条件和基质的不同而异。在中温条件下，优势菌种主要是专性厌氧菌，包括梭菌属(Clostridium)、拟杆菌属(Bacteriodes)、丁酸弧菌属(Butyrivibiro)、真细菌属(Eubacterium)、双歧杆菌属(Bifidbacterium)等。高温条件下则是梭菌属和无芽孢的革兰氏阴性菌。

在厌氧降解过程中，水解酸化菌群有两方面的功能，其一是产生和分泌水解酶，将大分子有机物(如多糖、蛋白质)水解成水溶性小分子有机物(如单糖、氨基酸);其二是将水解产物摄入胞内，并将其中一部分转化成代谢产物后分泌到胞外，为其他菌群(主要是产氢产乙酸细菌)提供营养基质(如脂肪酸、醇类等)。

(2)产氢产乙酸菌群

在水解酸化细菌的发酵产物中，除甲酸、甲醇、甲胺基类和乙酸能被产甲烷菌直接利用外，还有许多其他重要的有机代谢产物，如三碳及三碳以上的直链脂肪酸、二碳及二碳以上的醇、酮和芳香族有机酸等。这些产物须先由产氢产乙酸细菌转化成乙酸和H₂后，才能最终由产甲烷菌转化成甲烷。

(3)同型产乙酸菌群

在厌氧条件下能产生乙酸的细菌有两类。一类是异养型厌氧细菌，能利用有机基质产生乙酸，即酸化细菌;另一类是混合营养型厌氧细菌，既能将有机基质转化成乙酸，又能利用氢气和二氧化碳合成乙酸，这就是同型产乙酸细菌。由于这类细菌能利用分子态氢，从而降低了氢分压，因而对产氢的酸化细菌有利;同时，其产物又是一些利用乙酸产甲烷菌的营养基质。

(4)产甲烷菌群

产甲烷菌在分类学上属于古生菌，和参与厌氧降解过程的其他类型的细菌有显著的差异。迄今已分离到50多种产甲烷菌，可划分为7个类群18个属。常见的有产甲烷短杆菌属、产甲烷杆菌属、产甲烷球菌属、产甲烷螺菌属、产甲烷八叠球菌属和产甲烷丝菌属。

产甲烷菌能利用的基质主要有五种，即H₂/CO₂、甲酸、甲醇、甲胺基类和乙酸。绝大多数产甲烷菌能利用H₂/CO₂，而且其中有几种只能利用H₂/CO₂;有的产甲烷菌能利用乙酸;在有氢气存在条件下，仅能利用甲酸和甲醇的产甲烷菌各有一种;几种产甲烷八叠球菌能利用较多种类的基质。所有的产甲烷菌都能利用NH₄⁺作为氮源。此外，它们都需要金属镍作为产甲烷辅酶F₄₃₀的成分(镍四吡咯)，除镍外，铁和钴也是产甲烷菌所需的重要微量元素。

2.产甲烷的生化途径

对产甲烷生化过程的阐述，早期提出了两阶段理论，认为有机物的厌氧降解过程分两个阶段，即第一阶段的酸性发酵阶段，由水解酸化菌和乙酸发酵菌将复杂的有机物进行水解和发酵(酸化)，产生脂肪酸、醇类、CO₂、H₂等;第二阶段是甲烷发酵或产气阶段，由产甲烷菌将第一阶段的一些发酵产物进一步转化为CH₄、CO₂和氨。

1979年，Bryant等人提出了厌氧降解的三阶段理论(图14-1)。与两阶段理论相比，Bryant强调了产氢产乙酸过程的作用和地位，并独立划分为一个阶段。

图14-1　厌氧降解三阶段、四阶段过程(引自吴创之等)

在第一阶段，复杂有机物经水解和发酵转化为脂肪酸、醇类等小分子可溶性有机物，如多糖先水解为单糖，再经酵解途径进一步转化为乙醇和脂肪酸，如丙酸、丁酸、乳酸等发酵产物。蛋白质则先被水解成氨基酸，再经脱氨基作用产生脂肪酸和氨;在第二阶段，以上产物被产氢产乙酸细菌转化成乙酸和H₂/CO₂;最后，产甲烷菌利用乙酸和H₂/CO₂产生CH₄。在众多的代谢产物中，仅无机的H₂/CO₂和有机的“三甲一乙”(甲酸、甲醇、甲基胺类和乙酸)可直接被产甲烷菌利用，其他代谢产物必须经产氢产乙酸细菌进一步转化为氢和乙酸后，才能被产甲烷菌吸收利用。乙酸是甲烷的主要前体物，许多试验表明，在厌氧反应器中大约有70%的CH₄来自乙酸的裂解。

厌氧降解四阶段理论(图14-2)由Zeikus等人提出，是在三阶段理论的基础上增加了同型耗氢产乙酸过程，即由同型产乙酸细菌把H₂/CO₂转化成乙酸。由这类细菌所产生的乙酸通常不到乙酸总量的5%，一般可忽略。三阶段理论和四阶段理论实质上都是二阶段理论的补充和发展。目前在废水处理工程中研究厌氧降解时仍以二阶段理论为主。

在三阶段、四阶段理论的基础上，近年来进一步揭示了厌氧降解过程中的物质和能量转化流通途径，并确定了参与该过程的一些特定微生物及其它们特有的酶和辅酶。此外，还证实硝酸盐还原菌和硫酸盐还原菌在厌氧降解过程中的重要作用。这两类细菌除能将简单有机物氧化成乙酸和重碳酸盐，将乙酸盐氧化成碳酸盐外，还能氧化氢气和甲酸。

3.沼气发酵

虽然沼气目前在我国能源消费中所占份额较小，但其开发和推广前景十分广阔，特别是在我国农村地区，推广沼气发酵可以做到一举多得。

(1)沼气发酵反应器

沼气发酵是一个复杂的厌氧降解过程，需要多种厌氧和兼性厌氧菌的参与，其反应机理比较复杂。然而，对小型化沼气发酵而言，所需的生物反应器却相当简单。图14-2是在农村简易沼气发酵装置的示意图，这种发酵装置结构简单，建造成本低，因此很适合在农村进行小规模家庭式甲烷生产。

图14-2　简易的甲烷发酵装置示意图(引自吴创之等)

1—进料口，2—进料管，3—发酵间，4—储气间，5—出料管，6—水压间，7—活动盖，8—导气管

(2)影响沼气发酵的主要因素

①温度。沼气发酵与温度有密切关系，在一定范围内，温度越高，产气量也越高。但是产气量并不与温度升高成正比，在30～60℃之间有两个产气高峰:一个介于30～40℃之间，另一个介于50～60℃之间，这是不同厌氧降解菌群作用的结果。实践证明，农户沼池采用20～28℃的常温发酵比较适宜，而在城市一些有大量余热的废水处理中，采用52～58℃的高温发酵比较合适。

②酸碱度。不产甲烷的厌氧降解菌群一般对酸碱度的适应性较强，但产甲烷菌对酸碱度的适应范围较窄，只有在中性或微碱性的环境中才能正常生长繁殖。所以，沼气发酵液的pH值应控制在6.5～7.5范围内。在正常情况下，沼气发酵过程中的pH值变化是一个自然平衡过程，无须进行人为调节。但如果配料不当，或操作管理不合理，可能会导致大量挥发酸(主要是丙酸)积累，从而使pH值下降。在这种情况下，可以通过换料或添加适量的草木灰、氨水等来提高pH值。

③发酵原料。在厌氧发酵过程中，原料既是产生沼气的基质，又是沼气发酵菌群赖以生存的营养物质。除矿物油和木质素外，自然界中的有机物一般都能被微生物发酵产生沼气。由于生物利用率的差异，不同原料有不同的产气量(表14-3)。

表14-3　　几种常用发酵生产甲烷的原料及沼气产量

④厌氧环境。在厌氧降解过程中，大多数不产甲烷的细菌须在无氧条件下才能将复杂的有机物分解成小分子有机酸等简单化合物。同样，产甲烷菌是专性厌氧菌，不含过氧化氢和过氧化物酶，氧对它们有毒害作用，不能生活在有氧的环境中。因此，修建沼气池要确保池壁不渗水、不漏气。