环境样品采集和处理

一、环境样品采集和处理

环境样品的采集和处理是研究环境微生物的开始。要从研究目的、环境条件、采样条件的实际出发，制定可行科学的采样方法，其中最基本的原则是使样品具有代表性，通过对样品的分析能说明所研究生境(或环境)的环境微生物数量、结构、活性等参数，为环境微生物的研究提供科学、可靠的资料和数据。

1.土壤和沉积物

土壤是一种不连续、异质的环境，含有大量不同的生物体。微生物的数量及活性因土壤的深度和类型而发生很大的变化，甚至在同一地点因为天然微环境的不同而存在完全不同的微生物。由于群体间巨大的差异，为得到某地有代表性的微生物分析，多点采样往往是非常必要的。因此，总体采样方案将取决于许多因素，包括分析目的、可用资源以及采样地点状态。最精确的方法是在一个指定地点内采取多个样品，然后对每个样品进行单独分析。然而，在许多情况下，将采集的不同样品混合成一个复合样品，以减少分析工作量。另一种方法是在同一地点的一段时间内连续采样而后进行分析。为了保证采样的质量，采样策略、采样方法和样品保藏最为重要。采样策略包括:样品的数量和类型、位置、深度、时间、间隔;采样方法:采用专一的技术和设备;样品保藏包括:容量的类型、保存方法、最长保存时间。

(1)表土采样技术及方法

采集表土样品可用铲子，但使用土样掘凿钻可能更好，因为使用后者更精确，能保证采样的深度相同，深度在土壤样中特别重要，氧气、湿度、有机碳含量和土温受到深度的强烈影响。采样过程中还要防止污染(为分析微生物的采样)，尽可能保持采样器清洁，或用无菌刀将土样芯的外层刮掉，而只用内芯进行分析。

土壤的异质性以及采样钻的有限直径，所以采得的样品并不一定真正代表该采样点。因此可以采集几个样品并混合一个复合样品，以便减少样品总量及相关的分析费用。要获得复合样品，一般先是大面积采样，随后从每个样品中称取等量土样，并将它们放进桶或塑料包里。然后进行混合，这样就得到了复合样品。为了减小样品的体积以便于储藏，可以去掉一部分复合样品，从而得到可供分析的样品。在所有情况下，在处理和分析前，样品都应该冷冻保存。

在采样点的设置上有时设定一系列实验样方，例如测试土壤改良(如肥料、杀虫剂或污泥)对微生物群体的影响。在这种情况下，土样必须从每个不同的样方中采集，以便将未处理的样方同已改良的样品进行对比。

采样点设置方案有二维采样模型，这种模型包括随机采样、横切采样、两级采样及方格采样。在考虑采样深度时，需采用三维采样。

(2)地下采样技术与方法

地下采样一般需要特殊的装置和技术，并有一系列严密的操作过程，保证所取样品具有代表性。

对于未饱和系统，可用空气旋转钻取样，取样深度可达几百米。在该装置中，用一个大的压缩机将空气向下压入一根钻管，推动钻管下钻，空气从钻头逸出，将钻渣吹出洞口，同时也冷却芯筒。冷却非常重要，如果钻探管过热，样品中的微生物就会因过热死亡，给后续的微生物分析带来困难。

饱和地下环境采样的情况稍有不同，这是因为沉积物的黏着性比未饱和土样小得多。因此，钻孔口必须保持开启以便在每个想要的深度都能取到完整的土样。在这种采样中，广泛使用的是一种带采样推管的中空采掘钻。

(3)样品的处理与保存

样品一旦离开原来的位置就会发生变化，因此对样品的微生物及其他方面的分析要尽快进行，以尽可能降低离体分析所带来的影响。

表层土样进行微生物分析的第一步通常是用一个2mm规格的筛子除掉石子和碎片，此前通常样品要被风干，以利于筛分，但需保证土壤水分含量不要太低，以防微生物群体的减少。过筛之后，应该将样品在4℃下短期保存以待分析。

地下样品处理必须十分小心，其原因有3个:①它们只有较少的数量，这样外界的微生物污染就会显著影响其计数;②地下沉积物通常不与大气接触，大气中的微生物污染可能会从本质上影响样品中检出微生物的类型;③地下土样的采集耗费比地表高得多，而且一般不会有第二次采集的机会。一般地下样品应尽量立即整体冰冻并送实验室，也可就地处理。

2.水样

(1)采集水样的技术及方法

环境水样的采集和后续的分析都较土壤样品容易一些。主要原因在于水样比土样均一，减少了两个相邻样品的差异;从不同地点采集不同体积(1～1000ml或更多)较易;易于采得一系列大量的水样。水样采集一般用采样器采集。

(2)病毒分析水样的采集与处理

由于病毒数量少，存在的种类多，水样中病毒的检测和分析通常很困难。病毒分析包括四个基本步骤:样品采集、洗脱、重新浓缩和病毒检测。

①样品采集:包括饮用水、地下水、地表淡水、海水和污水等多样水体都涉及病毒分析，水体中病毒数量少，因此都要经浓缩，而水在物理-化学组成上差异极大，并会有溶解或悬浮于溶液中的多种物质，这些物质可能干扰浓缩。具体浓缩方法依赖于水样可能的病毒密度、水样浓缩方法的体积限制以及干扰物质的存在。从水中浓缩病毒所采用的不同方法如表15-1。

表15-1　　浓缩水中病毒的方法

②样品洗脱与再浓缩:一般采用加压使小体积的洗脱液(1～2L)通过滤器从滤器表面洗脱被吸附的病毒。洗脱液一般是偏碱性的蛋白质溶液，如pH值为9.5的1.5%牛肉提取液。pH值的增加提高了病毒和滤器表面的电负性，使病毒从滤器上解吸下来。洗脱液体积一般过大(1～2L)，不适于进行分析，因此一般要再浓缩(第二次浓缩)，使体积减少到20～30ml。再浓缩的方法一般采用絮凝再离心的方法。

③病毒检测:不同样品按不同的目的，不同方法检测(见后面)。

(3)检测细菌水样的采集与处理

检测细菌水样的采集与处理比较简单，按一般取水样的方法和处理即可。一般情况下，细菌可通过两种不同处理过程中的一种来收集:膜过滤和最大概率数(MPN)法。膜过滤通过过滤收集和浓缩细菌。在MPN法中，分析前一般不处理样品，在两种方法中，都是通过培养来检测细菌。