限制性片段长度多态性(

五、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism analysis，RFLP)分析

1.概述

限制性片段长度多态性分析经常被用于细菌分离菌上。这个方法首先要从细菌分离菌的纯培养物中提取总DNA，这个过程使用标准方法进行溶胞和制备DNA基因组。基因组DNA用核酸内切酶(通常认识4～6bp长的特异DNA序列)切割成小片段。一些内切酶的靶位点见表15-9，DNA片段通常用凝胶电泳分离，随后用溴化乙锭染色和紫外线照射显色。如果限制酶在基因组DNA内许多位点切割，就能产生几个甚至几百个DNA片段。电泳后这些片段的图形和探针探索会产生具有原始细菌分离物特征的指纹。

图15-12　lacZ基因的互补(引自Maloy，Cronan and Freifelder，1994)

表15-9　　一些限制性内切核酸酶的靶位点

续表

A^*

是N⁶-甲基腺嘌呤，C

*

是5-甲基胞嘧啶。

注:识别序列从5'端到3'端，只给出一条链，箭头指示切割点。圆括号里的碱基表示二者之一都可能占据这个位置。碱基已知被特异甲基化酶修饰的用星号^*表示。

引自Old and Primrose，1989。

2.全基因组的RFLP分析(RFLP analysis of whole genomes)

溶胞以后，细菌DNA可像前述那样被分离和纯化，然后可用限制酶在特异识别位点进行切割。因为插入、缺失或置换一个碱基引起的变化能产生或消除一个识别位点，所以限制位点也会变化，即使在亲缘关系很近的细菌中也是如此。亲缘关系远的细菌就会具有许多位置不同的限制位点，这些微妙的变化称为多态性。DNA多态性产生不同识别位点，因而导致不同的分离菌产生不同大小的限制片段。凝胶电泳后用溴化乙锭染色所观察到的图形可拍照用作实际指纹。

然而，往往难以解释大量的限制片段，并且在某些情况下限制片段很多，所以观察到的只是不清晰的成片电泳带。为了简化这种图形，可把这些DNA片段转移到一种膜上，只有含特异序列的片段能用基因探针检出。许多革兰氏阴性肠细菌含有重复的DNA序列，它们位于这种细菌染色体的不同位点。因为这些序列在进化上是保守的，所以利用这些序列的基因探针可以被设计出来。如果一特定分离菌的基因组DNA用特异的限制酶切割，那么某些DNA片段会含有这种保守性重复DNA序列。使用基因探针可鉴别这些片段，并且，同种的两个不同株会产生不同的指纹图形。

3.PCR序列的RFLP分析(RFLP analysis of PCR sequences)

RFLP分析还能用于鉴别或确证特异的细菌相关的特异基因序列而不是全细菌DNA。这项分析技术先对特异序列(如16S rDNA序列)进行PCR扩增，然后进行限制酶酶切。所有的细菌都含编码核糖体RNA的16S rDNA序列，而且这些16S rDNA序列的部分是高度保守的，而其他一些部分序列对每一机体来说是特异的。从这种保守序列设计出的引物称为“通用”引物，它在理论上会扩增所有已知细菌的16S rDNA。两个外部通用引物之间被扩增的DNA含有能被限制酶切割的独特序列，切割后会产生细菌分离的指纹。PCR-RFLP分析能描述细菌属自然种群的特征。一般扩增DNA至少要用两酶切割才能确保对不同分离菌的判定。

4.脉冲电场凝胶电泳

脉冲电伤凝胶电泳(pulse field gel eletrophoresis，PFGE)是分离高分子质量DNA的一种电泳技术，与一般的电泳不同。这是使DNA分子处在两个相互垂直的，交替变换的电场中移动，使分子质量大小不等的DNA片段分开。用这种电泳技术目前可分辨5000～20000kb的DNA分子。PFGE可用于多态性检测。与正常的RFLP相比较，它不需DNA向膜的转移，也不需用基因探针检出特异片段。限制酶酶切物在电泳中被分离染色，产生指纹。PFGE用于检出相对分子质量比正常RFLP中高的片段，这些片段通常大于40kb。这些大片段往往通过使用少数的切割酶产生(例如Not I)。全部的溶胞和限制酶酶切过程都在由细菌肉汤培养物和熔化的琼脂糖构成的填料进行。电泳前，这种填料熔进凝胶上样孔。这种方法可减少DNA的亲剪切。

5.RFLP分析的优点和不足之处

RFLP分析常用于鉴别特异细菌分离物。RFLP结合基因探针分析的最大优点是产生的带型清楚明确。这是因为相当大量的DNA被切割，电泳和染色后的DNA片段易于显示出来。相反，PCR产生的指纹(如AP-PCR或ERIC PCR产生的指纹)难以再现并可能含“模糊的”或“假的”带，使其难以解释。

RFLP分析用的限制酶选择通常凭经验，正常情况下必须使用多种酶。例如，如果将单酶用于两种染色体制品，随后的基因探针分析产生两种不同的指纹，那么毫无疑问这些分离菌是不同的。但是，如果产生的指纹是一样的，这倒不一定意味着这些分离菌是一样的，因为一种酶可能在两种DNA制品的同一位点进行切割。