胁迫对种对虾血清免疫酶活力的影响

3.3.1　诱导型一氧化氮合成酶（iNOS）活力

对照组的中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾iNOS活力大小依次为：8.27、12.96、11.63 U/（mgprot·h），且差异极显著（P , 0.01）。低pH胁迫组与各自的对照组相比，随着胁迫时间的延长中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾3种对虾血清的iNOS均表现出先升高后降低的趋势，且分别在3 h（P , 0.05）、4 h（P , 0.05）、12 h（P , 0.01）时达到最大值，分别为：11.90、16.41.12.38　U/（mgprot·h），随后逐渐下降；高pH胁迫组与各自的对照组相比中国对虾、凡纳滨对虾的iNOS活力随着时间延长逐渐下降，而日本囊对虾iNOS活力在3 h（P , 0.01）达到最大值，为22.13 U/（mgprot·h），然后随着时间延长呈现降低的变化趋势。pH条件改变后，3种对虾血清iNOS变化幅度为：中国对虾 . 凡纳滨对虾 . 日本囊对虾；两个pH胁迫组相比，低pH胁迫组中国对虾和凡纳滨对虾的血清iNOS活力较高pH胁迫组变化幅度大，而日本囊对虾的血清iNOS活力相反。

图4　3种养殖对虾在不同pH水体中的血淋巴iNOS酶活力

3.3.2　酚氧化酶（PO）活力

对照组的中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾PO活力大小依次为：0.0.2　7.0.006　7、0.0.8　2（U/mg），且差异极显著（P , 0.01）。与各自的对照组相比，低pH胁迫组随着胁迫时间的延长，中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾PO活力均呈先增后减的变化规律，且峰值都出现在12h（P , 0.01），最大值分别为：0.0.1　0.0.022　0.0.034　5（U/mg），之后PO活力逐渐下降；高pH组3种对虾的PO活力也呈现先增后减的变化规律，日本囊对虾在12 h（P , 0.01）达到最大值（0.048.4　U/mg），而凡纳滨对虾和中国对虾在6 h（P , 0.01）达到最大值，分别为：0.0.1　9.0.039　0 U/mg，随后均逐渐下降。pH条件改变后3种对虾PO活力变化幅度大小依次为：中国对虾 . 凡纳滨对虾 . 日本囊对虾；两pH胁迫组相比，高pH胁迫组3种对虾的PO活力均较低pH胁迫组变化幅度大。

图5　3种养殖对虾在不同pH水体中的血淋巴PO酶活力

3.3.3　溶菌酶（LSZ）

对照组的中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾LSZ活力大小依次为：0.058、0.086、0.074（μg/mL），且差异极显著（P , 0.01）。与各自的对照组相比，低pH和高pH胁迫组随着胁迫时间的延长，3种对虾的LSZ活力都呈逐渐下降的趋势且差异极显著（P , 0.01）。3种对虾血清LSZ活力在96 h内变化幅度依次为：凡纳滨对虾 . 中国对虾 . 日本囊对虾；两个pH胁迫组相比，低pH胁迫组3种对虾的血淋巴LSZ活力均较高pH胁迫组变化幅度大。

图6　 3种养殖对虾在不同pH水体中的血淋巴LSZ酶活力

3.3.4　超氧化物歧化酶（SOD）活力

对照组的中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾SOD活力大小依次为：94.81、109.69.175.56（U/mL），低pH和高pH胁迫组3种对虾SOD活力随着胁迫时间的延长均呈逐渐下降的趋势，且96 h后极显著地（P , 0.01）低于初始水平。另外，高pH组日本囊对虾SOD活力的变化幅度明显高于低pH组，而中国对虾和凡纳滨对虾却相反，表现为低pH条件下变化幅度更大的现象。pH胁迫后96 h内3种对虾SOD变化幅度依次为：中国对虾 . 凡纳滨对虾 . 日本囊对虾；两个pH胁迫组相比，中国对虾和凡纳滨对虾的血淋巴SOD活力，低pH胁迫组变化幅度较高pH胁迫组大，而日本囊对虾的血淋巴SOD活力高pH胁迫组变化幅度较低pH胁迫组大。

图7　3种养殖对虾在不同pH水体中的血淋巴SOD酶活力

3.3.5　谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）

对照组中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾的GSH-PX活力大小依次为：372.00、295.41、616.53（U），且三者之间差异极显著（P , 0.01）。两胁迫组3种对虾血淋巴GSH-PX活力随着胁迫时间的延长均呈逐渐下降的趋势。pH条件改变后96 h内3种对虾GSH-PX酶活力变化幅度依次为：日本囊对虾 . 中国对虾 . 凡纳滨对虾；两个胁迫组相比，低pH胁迫组中国对虾血淋巴GSH-PX活力变化幅度较高pH胁迫组大，而凡纳滨对虾和日本囊对虾血淋巴的GSH-PX活力高pH胁迫组较低pH胁迫组变化幅度大。

图8　3种养殖对虾在不同pH水体中的血淋巴GSH-PX酶活力

从本研究的结果可以看出，与各自的对照组相比，低pH和高pH胁迫都会使3种对虾的存活率随着pH改变时间的延长而逐渐下降，而且中国对虾和凡纳滨对虾出现死亡个体的时间均较日本囊对虾早，高pH条件下3种对虾存活率下降的幅度大小依次为：中国对虾 . 凡纳滨对虾 . 日本囊对虾；低pH条件下表现出同样的现象；两个胁迫组之间相比，高pH胁迫组的存活率下降幅度比低pH胁迫组大，由此可以推测高pH胁迫较低pH胁迫危害更大；3种对虾相比，日本囊对虾对pH胁迫的耐受性较强，耐受范围较广，凡纳滨对虾次之，中国对虾耐受性较差，这与目前养殖成活率实际情况相吻合，并且李少菁等（1998）研究报道日本囊对虾仔虾的死亡率与重金属浓度对数呈显著的正相关，但仔虾对离子的调节能力很强，可通过一定的调节机制抵消盐度等理化因子对金属摄入速率的影响，在最适的盐度范围内，日本囊对虾仔虾对重金属的耐受性最强，而哈承旭等（2009）报道的高pH（pH 9.4）胁迫72 h中国对虾全部死亡，以上研究与本实验的研究报道结果一致。

Na1-K1-ATPase存在于一切动物细胞膜上，参与细胞膜两侧的Na1，K1离子的跨膜主动运输。自QUINN和LANE（Quinn et al，1966）首次报道了甲壳动物鳃上皮存在Na1-K1-ATPase后，从此开始了对甲壳动物Na1-K1-ATPase活性的研究（房文红等，2001；吴众望等，2004；潘鲁青等，2004）。甲壳动物鳃上皮顶部细胞膜上具有Na1/H1交换体系，水环境中的Na1和细胞内代谢出来的H1主要是通过此交换体系进行交换；SHAW（1960）研究证实了当外界H1浓度过高时，河螯虾（Astacuspallipes）吸收外界Na1的能力下降，同时排泄鳃上皮细胞内H1的能力也下降。

本实验中，3种对虾鳃Na1-K1-ATPase活性都随着pH胁迫时间的延长而出现先升高后趋于稳定，这与潘鲁青等（2004）报道的凡纳滨对虾鳃丝Na1-K1-ATPase活力随着pH突变时间增加呈峰值变化结果一致。以上研究说明对虾对pH的变化具有一定的渗透调节能力，对虾机体为维持体内环境的pH平衡，短时间内鳃Na1-K1-ATPase活力升高，然后通过调节鳃上皮细胞的结构而改变离子的通透性，或者通过调节其他离子转运酶如碳酸酐酶（参与Na1/H1和Cl1/HCO3-的交换运输）活性等机制来适应pH变化，而使鳃Na1-K1-ATPase活力趋于稳定，由此增加了机体的能量消耗。林小涛等（2000）报道当水体中的pH值高于或低于某一范围时，都会改变甲壳动物的呼吸活动，影响鳃从外界吸收氧的能力，进而影响其耗氧率。在张林娟等（2008）的研究中也提到Na1-K1-ATPase酶参与了仔虾渗透调节过程，但对于甲壳动物鳃丝离子转运酶对环境胁迫的具体调节机制尚无定论，所以有关此方面的问题还需在多因素交互条件下，逐步深入研究加以论证。从3种对虾鳃Na1-K1-ATPase活力变化幅度来看，日本囊对虾离子转运酶变化幅度较小，这可能与其耐干露、潜沙等生活、生理习性有关，而凡纳滨对虾和中国对虾离子转运酶变化幅度较大。

本实验对中国对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾血清的iNOS、PO、SOD、LSZ、GSHPX重要免疫因子进行了比较分析。发现低pH和高pH胁迫下日本囊对虾血清iNOS均表现出先增后减的趋势，其中高pH条件下酶活变化幅度较低pH条件变化大，这与吴无利等（2008）报道的镉胁迫对凡纳滨对虾血清中一氧化氮合成酶的影响结果相似（2002）。凡纳滨对虾和中国对虾的低pH条件下iNOS活力先上升后下降，而高pH条件下iNOS活力则逐渐下降，这可能是由于高pH胁迫超出了对虾的耐受范围导致的。

本研究中3种对虾pH胁迫下的PO活力均呈现出先升高后降低的趋势，而且三者的高pH条件下PO活力变化幅度较低pH条件下的大，表现出高pH变化免疫适应性较差的现象，显然pH胁迫激活了对虾的酚氧化酶系统，使得PO活力升高，这虽是一种保护性反应，但当这种应激达到一定强度或者长期处于应激状态下时，会导致虾体代谢紊乱，故又出现酶活力下降的趋势，这与SODERHELL等（1990）的观点一致。

本实验中，3种对虾血清的LSZ、SOD、GSH-PX活力均随pH变化时间的延长而降低。根据结果分析可知，3种对虾血清的LSZ在低pH条件下变化幅度较高pH条件下的大，且低pH和高pH条件下LSZ都随着pH变化时间的延长而下降，这与潘鲁青等（2002）报道的盐度、pH突变对中国对虾和凡纳滨对虾免疫力的影响结果一致。

本研究中SOD活力逐渐下降，与LI和CHEN（Li et al，2008）研究低pH和高pH条件对凡纳滨对虾免疫因子的影响结果相似，这可能是由于pH应激强度过大导致对虾机体代谢紊乱，使得虾体的免疫机能受到抑制，酶活力下降。在哈承旭等（2009）、黄旭雄等（2007）的报道中，SOD活力总趋势先升高后降低说明当生物体受到外界刺激后，其活性会在一定范围内升高，这是生物体产生的一种保护机制，但若生物体持续地处于应激状态或应激强度加大时，机体的免疫功能会受到抑制，SOD活性降低（王文博等，2002），这和本实验结果并不矛盾。

GSH-PX是机体内广泛存在的一种催化过氧化氢分解的酶，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用（王雷等，1994；Chen et al，1997）。本实验中GSH-PX的下降表明pH胁迫后，对虾非特异免疫功能下降，抗氧化能力降低。

综上所述，高pH胁迫较低pH胁迫对3种对虾的存活率影响大，pH改变后中国对虾鳃Na1-K1-ATPase活力、血淋巴PO、SOD变化幅度较大，并表现高pH变化适应性较差的趋势，这种变化趋势与高pH胁迫状态下中国对虾高死亡率的结果一致，因此推测对虾Na1-K1-ATPase活力、PO、SOD活力与pH胁迫更相关，但是3种生理指标之间哪个先起作用及详细的协调途径还需更加深入研究；3种对虾相比，日本囊对虾存活率下降较低，离子转运酶、非特异性免疫酶活力变化幅度较小，对pH胁迫耐受性较强，凡纳滨对虾其次，中国对虾最弱。