基因片段序列分析

对3个群体27个样品的线粒体16S rRNA基因片段进行PCR扩增和序列测定（图4），得到长度为523 bp的基因片段，共出现3种单倍型（Haplotype1，2，3），其中一种单倍型与GeneBank中的序列完全相同，另外2种单倍型序列在GeneBank中注册（登陆号码为GU321227和GU321228）。我国会场群体中检测到2个单倍型（Haplotype2，Haplotype3），日本北海道群体中检测到2个单倍型（Haplotype1，Haplotype3），韩国东海岸群体1个单倍型（Haplotype3），其中Haplotype3为3个群体共享。共检测到4个变异位点，包括1个单一变异位点、1个简约信息位点和2个插入/缺失位点。韩国东海岸群体没有检测到多态位点，我国会场村群体检测到2个多态位点：251位出现1个C-T转换，403位出现1个A-T颠换，2个插入/缺失位点：255位插入1个T，406位插入1个A。日本北海道群体检测到1个多态位点，1个插入/缺失位点。251位出现1个C-T的转换，255位插入1个T。统计发现，三疣梭子蟹种内的单倍型多态性（Hd：0.145）、平均核苷酸差异数（K：0.217）和核苷酸多样性指数（Pi：0.0.0　14）均较低，而与拟穴青蟹、锯缘青蟹、远海梭子蟹、塞氏梭子蟹及日本间的平均核苷酸差异数均为1.3.3　33，核苷酸多样性指数分别为0.0.2　62.0.002　58、 0.0.2　57.0.002　56.0.002　68。显然，利用16S rRNA基因片段可发现种间的较大差异，但没有明显差异。经分析，不同群体的碱基含量基本一致，A、T、G、C含量平均为35%、35.7%、17.8%、11.5%，A1T含量明显高于G1C含量，符合无脊椎动物线粒体DNA序列特征。

图4　三疣梭子蟹不同单倍型及其他6种蟹的16S rRNA基因序列比较

注：“-”表示插入或缺失；“.”表示相同的碱基

用MEGA4.0软件，将3群体的3个单倍型分别与远海梭子蟹等5种蟹和1 种的对应16S rRNA基因片段序列做NJ聚类分析，经1 000次bootsrap检验后获得置信度，再用Kimura双参法算出个体间遗传距离（表12）。从表中可以看出三疣梭子蟹的种内遗传距离为0.0.2　～ 0.004，而与远海梭子蟹、塞氏梭子蟹间的遗传距离为0.0.2　～ 0.074.0.095　～ 0.111，与青蟹属和日本间的遗传距离为0.1.2　～ 0.150和0.1.0　～ 0.125。图5为基于16S rRNA基因片段构建的系统树，可见梭子蟹科的3个属聚为两大支：三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起，再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚为一支；青蟹属的三种蟹先聚在一起，再和日本聚为一支。

表12　基于16S rRNA基因片段计算的三疣梭子蟹各单倍型及外群间的遗传距离

续表

图5　三疣梭子蟹16S rRNA基因序列进化树

本书利用16S rRNA和COⅠ基因片段序列分析方法，证明3个群体间16S rRNA基因相对于COⅠ基因来说差异不明显，这与该基因片段的保守性有关。16S rRNA基因共检测到3种单倍型，各项遗传多样性参数较低，而COⅠ基因片段，共检测到19种单倍型，各项遗传多样性参数均较高。研究结果显示我国会场群体和韩国东海岸群体、日本北海道群体都有共享单倍型，说明我国的三疣梭子蟹野生群体和国外的两个群体之间遗传相似度很高。遗传多样性参数显示我国会场群体的核苷酸多样性指数低于国外两个群体，而单倍型多态性指数比国外两个群体略低、差异不大。会场群体核苷酸多样性指数0.00412高于戴艳菊等所研究的核苷酸多样性指数最高的莱州湾群体（0.0017）、低于冯冰冰等（2008）研究的核苷酸多样性指数最高的连云港群体0.00509.6　0.00123，但是对比日本北海道群体和韩国东海岸群体，本实验结果综合戴艳菊等以及冯冰冰等所作研究，我国三疣梭子蟹野生群体核苷酸多样性指数较低，表明我国三疣梭子蟹野生群体遗传多样性水平较低，原因可能是由于近年来我国沿海地区大规模的开发、人为干扰、捕捞强度增大使得三疣梭子蟹野生资源急剧下降，或者是由于盲目的人工移植和引种造成的，具体原因有待进一步研究。