多态性微卫星引物的筛选结果

经过PCR扩增、聚丙烯酰胺电泳和硝酸银染色，单态的标记有17个；多态性的标记有53个，其中适合进行微卫星多态性分析的有21对，其余33对引物多态性太低而未被采用。图19为Pot54位点在三疣梭子蟹30个个体中扩增得到的电泳图谱的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图19　Pot54位点在三疣梭子蟹30个个体中扩增得到的电泳图谱的聚丙烯酰胺凝胶电泳图

在微卫星标记的引物设计中微卫星序列的选取是非常重要和关键的。微卫星的核心序列有各种各样的类型，关于何种类型核心序列的微卫星筛选出微卫星标记的的可能性较大，一直以来众说纷纭。张天时等（2004）对各种类型核心序列进行了部分研究。结果表明，在扩增出PCR产物中的微卫星引物中，多态性的比例相对来说还是比较高的。筛选出的微卫星标记的核心序列是2个碱基、3个碱基或4个碱基为基本重复单位的序列，这与Pongsomboond等（2000）和Xu等（2001）斑节对虾（P.monodon）中以三碱基和四碱基为基本重复序列的微卫星标记筛选效果较好的结果相符。同样，在本实验中，21对微卫星引物的核心序列以2个碱基、3个碱基为基本重复单位的序列，21个微卫星位点的杂合度、多台信息含量均很高，显示出丰富的多态性，实验结果与以上研究成果相符合。

在微卫星核心序列的重复次数方面，Weber（1990）认为，只有在双碱基重复序列次数大于12次时，微卫星标记才有可能表现出较高PIC值，才可以进行相应的多态性分析。如位点Pot46和位点Pot47，以（GA）为基本重复单位，最多重复次数只有8次，所以等位基因数目少，分别为3个和9个，杂合度和PIC值也偏低。Xu等曾在斑节对虾进行微卫星引物设计，最后的结果也表明，凡是核心序列重复次数较少的微卫星标记，其结果或单太或等位基因数目非常少，PIC值也偏低。因此在选用的微卫星序列的核心序列的重复次数上应在一个较高的水平上，避免出现由于微卫星核心序列过短，造成微卫星标记筛选中多态性引物比较低而造成浪费。

利用微卫星引物对三疣梭子蟹海州湾群体30个个体进行遗传多样性分析。对每一个微卫星位点的等位基因数目（其中纯合个体的等位基因出现两次计算）进行统计。根据各个微卫星位点各种基因型频率计算其观察杂合度，根据各个微卫星位点的等位基因频率，分别计算它们的期望杂合度和多态信息含量（PIC），计算结果列于表12。

表12　三疣梭子蟹21对微卫星引物退火温度及其评价

续表

注：*表示严重偏离哈迪-温伯格平衡的位点

从表中可以看出，在三疣梭子蟹30个样本的21个微卫星位点中，统计21个位点共获得了188个等位基因，平均每个位点扩增得到8.9个等位基因。不同引物获得的等位基因数差异较大，从3～13个不等，其中Pot8、Pot37、Pot48、Pot53、Pot54、Pot66等6个位点分别获得了11、12、12、11、13、11个等位基因，而Pot46只获得了3个等位基因，等位基因的大小在131～312 bp，基本上符合引物设计时理论产物长度。期望杂合度的范围从0.716到0.913，表明它们都有较高的杂合度。PIC值从0.6.9　～ 0.889，21个位点的PIC值高于0.5，表明这些微卫星位点在三疣梭子蟹中均具有较高的信息含量。位点Pot66的观察杂合度与期望值有较大的出入，其他微卫星位点的这两值均基本相符。

在筛选出来的21对引物中，5对引物分别在3个个体中未扩增出谱带。这可能是因为在该位点上出现了无效等位基因（null allele）所引起的。无效等位基因的出现是因群体中个别个体引物结合位点的碱基出现缺失、突变或插入，在进行PCR扩增时引物与模版DNA无法结合，从而不能扩增目的片段。Ardren（1999）和李莉（2003）分别在虹鳟（S. gairdneri）和长牡蛎（O. gigas）的微卫星遗传标记中发现过无效等位基因。分析结果发现7个座位的观测杂合度和期望杂合度存在较大差异，经哈迪-温伯格平衡检验，是由于杂合子的严重缺乏（P , 0.005表中*所示）造成的。相关分析指出杂合子缺失大多由于无效等位基因引起。由于微卫星序列点突变频率（1022～1025）和复制滑脱频率（1023～1024）很高，无效等位基因存在包括哺乳类、鱼类、甲壳类在内的许多生物中。所以在种群研究中，如果无效等位基因存在而不被考虑，就会导致群体中纯合子过剩或杂合子缺失的现象，从而出现观测杂合度与期望杂合度偏离的现象。

遗传标记的多态性程度及其应用价值一般可用杂合度（H）、多态信息含量（PIC）、个体识别力（DP）和非父排除率（PPE）来衡量。根据Bostein等（1980）提出的衡量基因变异程度高低的多态信息含量指标，当PIC . 0.5时，该基因座为高度多态基因座；当0.25 , PIC , 0.5时，为中度多态基因座；当PIC , 0.25时，则为低度多态基因座。本实验结果显示21个微卫星位点多态信息含量PIC . 0.5，为高度多态性，在三疣梭子蟹群体遗传学研究中能提供确切的遗传信息。

本实验21个微卫星标记在30个样本中观测到3 ～ 13个等位基因，而与Pongsomboond等（2000）和Xu等（2001）在斑节对虾中筛选得到多态性最高的微卫星标记，其等位基因最多分别达到29和25个，大大高出本研究中所得到的最大等位基因数，可能是聚丙烯酰胺电泳以及在微卫星位点的等位基因统计中出现的偏差对分析微卫星电泳结果可能有局限性。由于微卫星的较强多态性，常常使得两条电泳带（等位基因）之间仅仅只有几个碱基的差别，反映在电泳胶上可能非常近，在区分两条带时很可能造成误判，将两条非常近的带认为是1条。因此，建议使用测序仪的毛细管电泳结合荧光标记再利用其中的Genescan功能进行分析。

SSR标记在不同的群体中存在差异，有的等位基因为个别群体所特有，可作为群体遗传差异的特异带（王杰等，2006）。Barker（1994）研究指出，在利用SSR标记进行遗传距离分析时，要求SSR标记的等位基因数不少于4个，少于4个或没有扩增条带的SSR标记应该排除。基于这一理论，本实验筛选出的21对引物中有20对引物的等位基因数大于4，可利用这些位点来进行不同群体三疣梭子蟹的群体间遗传距离分析。罗云等（2010）利用SSR标记技术结合“拟测交”策略，以三疣梭子蟹莱州湾、舟山野生群体杂交产生的F2代家系为作图群体，初步构建了三疣梭子蟹雌、雄性遗传连锁图谱，图谱中遗传标记分布比较均匀，充分说明了SSR标记应用的合理性。

（作者：韩智科，刘萍，李健，高保全，陈萍）