噬菌体的合成

‍噬菌体phiX174的合成

20世纪60年代，阿瑟·科恩伯格利用DNA聚合酶在实验室成功复制了phiX174噬菌体的基因组并成功激活。那时，基因测序技术还未出现。phiX174也成了文特尔第一个DNA合成的目标。实验表明，包含5 384个碱基对的 phiX174合成DNA，在进入大肠杆菌后，能够感染、复制，并且杀死大肠杆菌的细胞。人工合成病毒取得了成功！

LIFE AT
 THE SPEED
 OF LIGHT

它将会是你、你的爸爸，甚至你的爷爷曾经读过的最重要的故事之一，这些人已经解开了生命的根本性秘密。这是一个真正了不起的成就。它在对抗疾病、为全人类构建更健康的生活方面打开了一扇通向未来的宽阔大门。它有可能是未来控制某些类型的癌症的第一步——这些伟大的研究天才们这样告诉我们。

——林登·约翰逊

尽管大多数普通人从未听说过phiX174，但这个简单的噬菌体已经在历史上赢得了它的一席之地。phiX174是第一个被测序的DNA病毒，也是第一个自身的基因组被人工复制和激活的生物体。phiX174最早是在巴黎的下水道中被发现的，它的攻击目标是人体肠道内的细菌——大肠杆菌。一般人可能会想不明白，科学家为什么会把如此多的注意力集中在一个乍看起来如此不起眼的病毒身上，原因其实很简单：当你在分子水平上检查它的时候，并没有太多类似的病毒。

phiX174是由环状DNA染色体所组成的，它总共只有11个基因，被一个二十面体的蛋白质“外衣”所包裹着，有12个五角形的“锐刺”。虽然在电子显微镜下进行观察的时候，这个噬菌体看起来像是一朵美丽的鲜花，但是实际上它是一个冰冷的、几何状的东西。这个病毒比盐类晶体还难以存活，它的生命周期如下：这个噬菌体通过它的锐刺把自身的DNA注射到一个细菌细胞内，然后它就“劫持”这个细菌细胞的生化机制以创造出许多新的病毒。由此这个噬菌体的后代便从被支持的细胞中爆发性地繁衍起来，进而它们就能够继续感染更多的大肠杆菌。

科恩伯格，探索生命奥秘的先锋

在20世纪60年代，phiX174噬菌体就已经在实验室中被重新“创造”出来了，那时候，不但DNA测序技术还没有出现，甚至连这个噬菌体基因组的结构也没有被发现。这项工作是由生化学家阿瑟·科恩伯格（Arthur Kornberg）所领导的斯坦福大学的一个研究团队完成的。他们能够取得这一成就的关键是，科恩伯格发现了DNA聚合酶，这种酶对DNA复制起到了关键的作用。科恩伯格的实验室最早是在试管内用他们新发现的这种酶复制DNA的。根据科恩伯格的论文，他的研究团队起初试图复制一个细菌基因组，但是没有成功，主要是因为聚合酶无法连续不断地读取由数以百万计的DNA碱基对所组成的整个基因组。

这个实验失败后，科恩伯格决定做一件30年之后我的研究团队做的事情：他保守地选择了一个目标DNA进行复制，这个目标DNA就是phiX174。作为早期的基因合成和测序的开创者之一，罗伯特·L.辛斯海姆在那时已经发现了关于噬菌体生命周期的一些重要细节。尽管phiX174病毒的DNA是由一个单链环状DNA所组成的，辛斯海姆发现，当它感染了宿主之后，存在于细菌中的酶立即把这个环境中的DNA转变为通常的线状双螺旋结构。这个发现也解释了科恩伯格在他第一次复制病毒的基因组时所遇到的问题：虽然DNA聚合酶能够在线状形式下复制整个phiX174基因组（5 386个碱基对），但它不能创建有传染性的环状形式。如今我们所有人都知道如何把一条线变为一个圆环，但对半个世纪之前的科学家来说，在分子水平上实现这一点并非易事。

当然，大自然早就已经掌握了这种技巧，因此好几个科研团队，包括科恩伯格的团队，都在寻找一种细菌酶，它能够把线性双链的DNA的两端连接起来，使这个DNA变成一个完整的圆，就像一个“分子衔尾蛇”。这种搜寻工作在1967年结束了，因为那一年五个团队都发现了DNA连接酶——一种能够把DNA连接成一个环状的酶。到了1967年年底，科恩伯格已经使用DNA连接酶把phiX174 DNA的两端连接起来了，这样就能够利用DNA聚合酶对它进行复制了。现在这个复制出来的DNA已经有能力去感染细菌了。利用这种方法，科恩伯格已经在复制phiX174基因组、传递phiX174基因组了。他用这样复制出来的DNA去感染大肠杆菌，并制造出多个病毒副本。

然而，尽管他知道自己已经在这些“大致的轮廓”的研究中获得了成功，但是他确实不知道构成phiX174基因组的DNA序列到底是什么。直到十年之后，即1977年，当桑格的团队在他们的新测序方法上使用了DNA聚合酶，并运用新的测序方法来测定phiX174基因组的时候，科恩伯格才真正意识到自己“带给生命”的到底是什么。不过，科恩伯格的研究在当时就引起了巨大的轰动。1967年12月14日，斯坦福大学为他举办了一个新闻发布会，那时也正好是他的论文发表在《美国科学院院报》上的时候。会议的主办者要求记者不要把科恩伯格的成就描述为“合成生命”，因为病毒并不是生物，病毒是依赖于其他生命而繁殖的。但是，他们并没有把这个要求告诉所有人。

林登·约翰逊总统原定在那一天在史密森学会为纪念《大英百科全书》出版200周年而发表演讲，他的演讲稿撰写人曾经问过斯坦福大学有关DNA工作的进展状况。尽管在约翰逊总统的演讲稿中是涉及这个内容的，但是当约翰逊总统开始朗读经过撰稿人精心准备的演讲稿时，他突然把它放在一边，而把以下这个头条新闻告诉给了听众，这时候约翰逊总统完全无法掩饰自己激动的心情：

它将会是你、你的爸爸、甚至你的爷爷曾经读过的最重要的故事之一，这些人已经解开了一个生命的根本性秘密。这是一个真正了不起的成就。它在对抗疾病、为全人类构建更健康的生活等方面打开了一扇通向新发现的宽阔大门。它有可能是未来控制某些类型癌症的第一步——这些伟大的研究天才们这样说。

约翰逊总统肯定已经仔细思考过政府可以“决定生命”这个问题了。在现代，一个国家已经拥有了那种在过去被认为只有大自然或者甚至是只有上帝才能拥有的权力。在这个意义上，约翰逊总统上面这番话就显得意味深长了。“如果你仔细思考这位总统当前正在做的一些决定的话，你就会发现，这将成为最重大的问题之一，或者说，将成为最重大的决定之一。与未来某个美国总统将来要做出的一些决定相比，它将是一个至关重要的开端。”在这次演讲之后，全世界的头条新闻都是“这预示着第一个合成生命诞生的日子即将来临”，这个结果实在不足为奇。

我今生有幸，在数十年之后，终于听到了约翰逊总统所说的关于“生命的秘密”的这段话。我在2010年宣布了第一个合成细胞诞生的消息，后来我接受了全国公共广播电台的科学记者乔·帕尔卡（Joe Palca）的采访，采访时电台引用了约翰逊总统的录音。（而当年，当那个消息公布的时候，我正在越南的岘港市作为一名海军医护兵在服役，因此这个被约翰逊总统誉为对数代人来说都是最重要的故事从我身边溜走了。）我认为，重新发现这段轶事是一个令人愉快的经历，它也是科学思考连续性的一个极好的例证。就“合成生命”这件事情，目标一直没有改变，那就是通过重造生命来最终理解生命，问题在于，在既不过分夸张，也不故意炒作的情况下，如何把真正的、令人激动的科学发现的信息传达给公众，却是一个始终都会存在的难题。通过我的博士生导师内森·O.卡普兰（Nathan O.Kaplan）的介绍，我曾经与科恩伯格见过一次面。我不知道，如果科恩伯格在他早期实验的基础上进入基因组学领域，他将会做出什么样的非凡成就。

利用原始的病毒基因组作为模板来重新创造DNA病毒的这些努力，后来进一步扩展到更加原始的只拥有RNA代码的病毒，比如脊髓灰质炎病毒和逆转录病毒（例如，艾滋病病毒）。逆转录病毒也有一个RNA代码，但是它是利用一种能够把RNA转换成DNA的酶在宿主细胞中进行复制的。逆转录酶是在1970年被发现的，这个发现是一系列关于RNA肿瘤病毒研究的一个成果，它对“DNA让RNA制造蛋白质”这个中心法则提出了巨大的挑战。威斯康星大学的霍华德·马丁·特明（Howard Martin Temin）和麻省理工学院的戴维·巴尔的摩（David Baltimore）因为各自独立发现了逆转录酶而分享了1975年的诺贝尔生理学或医学奖。

在这些噬菌体RNA病毒中，有一种叫作Qbeta噬菌体，它是第一个通过逆转录酶在实验室里被重新创造出来的噬菌体。瑞士分子生物学家查尔斯·韦斯曼（Charles Weissmann）的努力把这项了不起的研究工作推向了高潮。韦斯曼是一位世界闻名的科学家，他最著名的成就是在苏黎世大学完成了一项有关朊病毒的研究，以及在第一个生物科技公司基因泰克公司成立数年之后的1980年，利用DNA重组技术制造出了蛋白质干扰素。1969年，韦斯曼与马丁·毕莱德（Martin Billeter）一起完成的有关RNA测序的早期开创性研究鼓舞了桑格。于是桑格与理查德·弗拉维尔（Richard Flavell）、韦斯曼一起于1974年打开了被称为“反向遗传学”的大门。反向遗传学与传统的遗传学截然相反，它研究的是改变遗传代码对生物体的影响，在研究中需要先识别出变异的生物体，然后再找到那个引起变异的突变DNA。

1974年，复制RNA病毒的技术又取得了一大进步。那一年，谷口维绍（Tadatsugu Taniguchi）加入到韦斯曼的研究团队，他们成功地生成了一个Qbeta RNA的互补双链DNA副本（互补DNA），他们还把它集成在一个质粒运载体上。尤其让韦斯曼感到“惊奇和高兴”的是，当把质粒植入大肠杆菌时，它会导致传染性的Qbeta噬菌体出现。这是在这个方面取得的第一次成功。有了这种制造病毒互补DNA的技术，我们就可以进行原本无法在RNA层面上进行的基因操作了，这样一来，也就意味着我们能够把DNA重组技术应用到RNA病毒上去了。几年之后，文森特·拉卡涅洛（Vincent Ra-caniello）和戴维·巴尔的摩利用纯化脊髓灰质炎病毒RNA和人类的癌细胞在麻省理工学院重做了这个实验：他们也获得了真正的病毒粒子。继这项研究工作之后，几乎每一个病毒家族成员的遗传代码都被报告了出来，包括丙型肝炎、狂犬病、呼吸道合胞体病毒、甲型流感、麻疹、埃博拉病毒、布尼亚病毒以及应该对1918大流感负责的流感病毒，等等。

逆转录酶和DNA聚合酶也有助于改进用于读取遗传密码的方法。逆转录酶通常用于从信使RNA那里制造出互补DNA的克隆体，它允许我们对表达基因进行DNA测序。这也就是我利用表达序列标签法时所使用的方法。从桑格的phiX174到流感嗜血杆菌，再到人类基因组，DNA聚合酶在DNA测序方面扮演了关键角色。为了读取人类基因组的30亿个碱基对，我的研究团队又开发了全基因组霰弹测序法。这种方法把基因组分解成一个个小小的片段，这样一来，这些片段就很容易通过DNA测序机器读取出来。1999年，我们把读取出来的2 500万个个体基因序列组合成一个完整的人类基因组花费了整整9个月的时间。而今天，DNA测序已经取得了极大的进展，由于出现了许多新的技术，它们能够让一台机器在一天里就测出一个人类基因组。

精度，合成基因组的关键

在赛莱拉公司完成人类基因组的测序工作后，我把自己的研究工作重心转回到研究最小生命所需要的基本元素以及合成基因组学的下一步工作上来。汉密尔顿·史密斯也离开了赛莱拉公司，加入了我的团队，为了获取资金，我们同时向美国能源部申请拨款。当时，能源部正在开展一个名为“基因组到生命”（Genomes to Life）的项目，这个项目是由人类基因组计划的成果演变而来的。在早期，美国能源部曾经资助我的研究团队完成了一些最初的基因组测序工作，包括生殖支原体和詹氏甲烷球菌的测序。最后，美国能源部批准了一个为期5年的计划，每年给我们提供500万美元的资助——这是一个伟大的开端，有了这笔资金，我们就有可能在两个全新的领域内同时进行探索，我们认为，在这两个领域内都存在着令人激动的机会。

第一个领域是在我的基因组测序早期工作基础上的一个大胆延伸，后来它被称为宏基因组学（metagenomics）。在这个领域中，我们并不集中关注某个特定的物种，相反，我们将在诸如海洋或人类肠道等各种各样的环境中寻求获得完整的微生物多样性基因的整体“快照”。我的许多同事都怀疑，以海洋生物为样本利用霰弹测序法对所有的生物同时进行基因测序是否有效，因为我们当时正在处理的是一种包含着大量不同物种的“汤”。之所以会出现这种怀疑的论调，是因为同时对目前存在的数以千计的基因组进行测序以及使用计算机把那些正确的片段彼此重新连接和组合起来是一个相当复杂的过程，一如我们在人类基因组计划中所做的那样。我相信，每个物种的遗传密码都是足够独特的，因此能够利用计算机从一大堆毫无关系的、杂乱无章的基因序列的“混合物”中完成重新编码。

后来的事实证明，我的环境霰弹测序新方法获得了极大的成功。我们是从百慕大群岛周围的马尾藻海里的水生样本开始的。由于缺乏足够的营养成分，这个地方被当时的很多人认定是一片海洋“荒漠”。但是，就在这片“贫瘠”的海域里，我们仅仅在一个样本里就发现了超过120万个以前从不知道的基因，它们至少涉及1 800个物种。这个“贫瘠”的海域其实充满了生命（因为这些生物体的能量是直接来自阳光的）。我们还发现，除了光合作用之外，几乎每一种生活于上层海水区的微生物都拥有一种光敏蛋白，即视紫红质光感受器，它与人类眼睛中的视紫红质光感受器非常相似。我们的“魔法师Ⅱ”号（Sorcerer II）探险工作的一部分是每隔300公里进行一次取样，在过去的6年时间里，我们已经走完了8万多公里的海域，在这个过程中，我们已经发现了8 000多万个基因。现在已经知道，以往所认定的一些“单一物种”，其实是由数以千计的关系紧密的生物体所组成的群落。经过大量的研究，我们估计在海洋中存在着大约1030种单细胞生物以及1031种病毒。这是一个巨大的数字，相当于地球上每个人都拥有十万亿个生物体。

美国能源部还资助了另一个研究领域，这使我们能够沿着最初的合成生命这条道路重新开始研究。克莱德·哈奇森曾经根据他自己与罗伯特·辛斯海姆和弗雷德里克·桑格的前期工作提出了一个建议，那就是把噬菌体phiX174作为一个测试项目。这里有几个理由可以解释为什么这个项目会成为一个非常有吸引力的目标。噬菌体的基因组规模很小，而且phiX174不允许出现太多的基因变化，因此它也可以成为检验合成精确度的一个非常好的“标准”。同时，它身上还隐含着大量的关于病毒的信息。感谢科恩伯格、桑格和辛斯海姆的努力。辛斯海姆是在受到马克斯·德尔布吕克的鼓舞之后开始研究噬菌体的，因此我们完全可以理解他会选择他所能找到的最小的噬菌体开始进行研究。

为了测试一个简单的合成方法，1997年，我们第一次尝试利用一系列由50个碱基对叠加而成的寡核苷酸来合成phiX174基因组，然后再通过一个聚合酶链式反应进行基因组复制。一开始，我们这个实验似乎很成功。克莱德·哈奇森的实验笔记记录了在4月22日我们是怎样制造出合适大小的DNA分子的（它的大小与一个完整的phiX174基因组相适应）。然而，最关键的问题随后出现了，那就是：要达到什么样的合成精确度才足以保证我们能够制造出病毒呢？我们的目标是利用合成DNA去感染大肠杆菌，如果DNA没有致命错误，这种细菌就会产生编码蛋白质，它将能够自己组合制造出更多的phiX174病毒副本。不幸的是，我们的合成基因组根本不具有感染性。当然，我们知道，DNA合成是很容易出错的，但我们希望的是，通过感染的选择过程，我们能够找到那个具有正确序列的万里挑一的DNA链。

不过，我们失败了，而且当我们意识到我们这次失败到底意味着什么的时候，上面那个希望也破灭了。即使是这样一个小小的病毒，精确合成DNA仍然是一个比我们所想象的还要更加困难得多的任务，更不用说制造出一个完整的细菌基因组，从而制造出一个活的细胞这种宏基伟业了。

因此，作为一个团队，我们现在需要好好筹划一下了：我们应该如何推进我们的研究？我们甚至还必须权衡一个更大的问题：实现合成生命这个最终目标是否有可能实现？不过，我们又得到了一个对人类基因组进行测序的机会，这个机会使我们对这一方面一些重要问题的思考推迟了好几年。但是，一等到我们成功地完成了人类基因组测序，我们就又重新回到了合成基因组这个更具挑战性的研究项目上来了。而且，我们下定决心，一定要取得成功。

由于在寡核苷酸合成过程中发生了一些不可避免的错误，我们在几年前合成phiX174的最初尝试明显失败了。如果DNA自动合成机器能够按照预先编制好的序列制造出纯化的、零错误的寡核苷酸，那么再对长长的双链DNA分子进行组合就会相对简单些。但是在现实中，只有约一半的合成分子会有正确的链长，其余的大多都是缩短的分子。通常，它们比预期要短的原因是，DNA自动合成机器有一个不能合成的基础片段，这个问题被称为N-1问题。这些错误的分子或者会导致停止合成寡核苷酸，或者会导致合成带有错误的基因代码的DNA。

我们首先进行了一个简单的计算，以便找到我们没有取得成功的原因。因为平均来说，用于组合噬菌体DNA的每两个分子中只有一个是正确的，这样在早年间我们的合成为什么会失败就非常明显了（这也非常令人沮丧）。从130个非纯化的寡核苷酸中，以随机选择的方式，完全正确地合成一条phiX174基因组链的概率大约只有10-39，这是一个极小极小的数字。我们估计，既然采用感染之后再进行选择的方法，也必须把不正确的寡核苷酸的比例减少到10%以下，因为只有这样，我们才能保证有机会制造出完全正确的分子。

大功告成：第一个合成传染性病毒phiX174诞生

就这样，我们回到基本问题上来了。首先，我们重新评估了我们想重构的基因组，以便确定我们是从一个精确的病毒序列开始的。我们的序列是建立在由桑格和他的同事在1978年撰写的那篇具有历史意义的论文的基础上的。我们是幸运的，因为克莱德·哈奇森保存了一个来自最初测序的病毒的样本，因此我们能够用最新的方法进行重新测序以检验桑格研究团队工作的精确性。我们发现，在5 384个碱基对中，只有3个是不一样的，我们不知道这是由于最初测序的错误，还是由于在样本的重新培养中发生了病毒变异。不管什么原因，这已经足以证明它是非常精确的，这是桑格研究团队努力程度的一个证明。

序列的精确度始终是基因组学领域的一个问题。绝大部分早期的DNA测序精确度远远不及99%（100个碱基对中只有一个是错误的）。只有少数实验室得到的结果才满足人类基因组设定的“高”标准，即每10 000个碱基对中只有一个错误。书写遗传密码的标准比读取DNA软件的现行标准还要整整高出几个数量级。这是因为，数字化的DNA序列将会成为基因组设计和合成的基础：既然要合成生命，那么基因序列必须是非常精确的。后来，当开始创造第一个合成生命的时候，我们在110万个基因代码字母中只发现了一个“拼写错误”。但是我们发现，即使只有这一个碱基对被删除了，也意味着生死之别。

根据辛斯海姆的研究成果，我们已经知道，phiX174基因组必须先变成环状才能具有传染性。为了创造一个功能性的环状合成基因组，我们把这个问题分成了几个步骤来解决。我们从计算机文件中的DNA序列开始，然后把基因组分成一系列足够小的、前后之间有所重叠的片段，以保证DNA合成机器能够发挥作用。为了合成噬菌体，我们设计了259个寡核苷酸，每个寡核苷酸的长度为42个碱基，它们覆盖了噬菌体的整个基因组（前后片段之间有一定重叠）。这个基因组链的“上链”由130个寡核苷酸组成，而“下链”则由另外129个寡核苷酸组成。因为phiX174基因组是由5 384个碱基对组成的，所以这个设计也必须考虑那个由42个碱基组成的片段的重叠部分——我们把它叫作42穆丝（“mers”这个单词源于希腊语中的“meros”一词，意为“部分”，它是对每个碱基而言的）。同时还要考虑我们添加到每个基因组末端的一个额外序列，它是用来复制基因组内只出现一次的限制性位点的，在这个位点上，限制性内切酶PstI能够把DNA切断，以便制造出能够把彼此连接起来的重叠性的末端部分，使DNA形成一个环状。

由于我们已经知道，在合成的42穆丝DNA片段中只有一半具有正确的长度，因此我们推断，通过简单地纯化寡核苷酸就可以极大地提高组合的精确度，DNA测序凝胶能够按不同的长度对DNA分子进行归类，它也能够把只有一个核苷酸差异的分子区分出来。这个过程叫作凝胶电泳（gelelectrophoresis），带负电荷的核酸分子在电场的影响下通过琼脂糖凝胶进行移动。被缩短的寡核苷酸更小，因此它们比大小合适的寡核苷酸移动得更快。利用刀片把凝胶简单地切成片，我们就能够分离出大小合适的片段，这样一来，我们就可以用它们把大小正确的phiX174链的顶端和末端组合起来了。

现在，我们已经得到了以纯化寡核苷酸链的形式来构建噬菌体基因组所需的元件了。由于设计当中需要有所重叠，因此接下来我们把寡核苷酸链的顶端和末端合并起来，并使它们按正确的顺序连接起来，就像“自组装”的乐高积木一样。然后我们利用DNA连接酶把这些片段永久性地连接起来。不过，与科恩伯格所使用的那种酶不同，我们所选择的是来自一种高温生物体的更为强劲的连接酶，因此它可以长时间地处于活跃状态。在让寡核苷酸池在55℃的温度下反应了18个小时之后，我们从那42个寡核苷酸碱基出发，重组出了一些平均大小约为700个碱基的片段，其中有些片段包含2 000～3 000个碱基。

我们运用一种被称作聚合酶循环组装法（PCA），利用这些较长的DNA片段生成了phiX174的完整长度的基因组序列。聚合酶循环组装法是聚合酶链式反应（PCR）的一个变种，而聚合酶链反应则是一种常用的DNA扩增的方法。利用聚合酶链反应方法，通过加热样本，我们能够扩增极少量的DNA，由此DNA会变性或熔化，这样，一个双链的DNA就被分离成为两个单链的DNA。接下来，以原始链作为模板利用具有耐热性的Taq酶制造出两条新的DNA链，这样就复制出了原始链，因此每个新分子都包含着一个旧DNA链和一个新DNA链。然后每一条链都能用于创造两个新的复制品，以此类推。

这个过程的一个变种被称为聚合酶循环组装，我们从来自最初组装阶段的所有较大的DNA片段开始（平均规模为700个碱基对），再一次把双链DNA熔化为单链DNA。我们没有利用DNA聚合酶复制单链DNA，相反，我们让反应冷却下来，因此单链DNA会与任何一条互补链再次退火，利用这种方法，就能得到成对的互补碱基。这样做的原因一般是，两条DNA链将只有在其中一端才会重叠，从而创造出一个更长的分子，这就像你的两个食指，只有它们的第一个关节相互连接起来才能连为一线。然后我们利用DNA聚合酶在每一端把缺失的碱基补上，这样就把单链的DNA转变为了双链的DNA。通过反复循环，我们能够构建出长达几千个碱基对的DNA片段，而且速度很快。这个循环会继续下去（它是随机连接的），直到分子增长到覆盖整个基因组为止。最后，常规的聚合酶链反应被用于扩增整个基因组序列。为了让这些线状的噬菌体基因组末端再次连接起来而形成具有传染性的环状，这个被扩增的分子被PstI酶切断，让序列的末端相互分离，随后彼此黏合在一起，从而形成环状。

接下来就到了至关重要的验证阶段。我们需要看看，我们是否能够成功地制造出一个正确的、具有传染性的合成基因组。要制造出一个具有传染性的病毒，合成DNA需要得到大肠杆菌细胞中酶系统的认可，即首先要被转录成信使RNA，然后还要通过大肠杆菌的蛋白质合成机器转变为病毒的蛋白质。为了确保我们的合成DNA能够进入目标——大肠杆菌宿主细菌，我们利用一种叫作电穿孔（electroporation）的方法，电场能够把大肠杆菌的细胞壁凿出一些小小的临时性的孔。当大肠杆菌被合成的phiX174感染后，它能够在培养皿的琼脂（一种类似于琼脂糖和琼脂胶混合而成的胶状物）中传播，并且能够在37℃的条件下培养成活6～18个小时。

如果在大肠杆菌的菌苔上出现了斑块——那是一种非常明显的环状物，那么我们就能够确定上述新方法奏效了。因为这种斑块将表明，病毒蛋白已经在细菌内部被成功地“生产”出来了，并且自我“组装”成了足够多的phiX174病毒副本，这将导致宿主细胞爆裂，释放出病毒，并且在这个过程中感染周围的大肠杆菌细胞。当史密斯打开培养皿之后，他给我打电话让我尽快到实验室去。当他把第一个盘子给我看时，我非常高兴：盘子上到处都是明显的斑块。合成DNA噬菌体的确能够感染、复制，而且能够杀死细菌细胞。史密斯、哈奇森和我都非常激动。重要的是，我们创造合成基因组以及感染细胞的整个过程只花了两个星期的时间。

其实，我们的成果还应该放到更大的背景中去考察，那样它的意义就可以更加清楚了。在一年前，纽约州立大学斯托尼布鲁克分校的埃卡德·威默（Eckard Wimmer）就发表了一篇报告：他领导的研究团队也制造出一个部分有效的病毒。这无疑也是一个壮举，因为他们采用的是一种“一步一步来”的程序。其实，早在1981年，威默和他的同事就已经公布过一个脊髓灰质炎病毒的基因序列，这一次，为了制造出他们的第一个合成RNA病毒，他的研究团队根据这个序列，花了整整三年时间，先利用无数很小的合成DNA寡核苷酸组装出这个包含7 000个碱基的脊髓灰质炎基因组，然后，再利用RNA转录酶把这个合成DNA转化成具有传染性的病毒RNA。不过，与我们在合成寡核苷酸时一样，他们在制造这第一个合成RNA脊髓灰质炎病毒时也犯了同样的错误，因此，这种错误大大降低了病毒的活性。威默所取得的成就的唯一一个消极方面在于，他在将这一成果公布出来的时候，决定更多地将它作为对科学界的一种警告，而不是作为一个突破性科学研究成果，这就引发了极大的争议，也吸引了公众的注意。

紧随着威默的成果之后，我们也取得了突破，而且我们把创造一个病毒所需要的时间从以年来计算迅速地减少到以天来计算。由于威默的研究工作一直都是由美国能源部资助的，所以我联系了这个部门，告知政府我们在这个方面所取得的成功。这一次，官方的反应非常迅速，正如我在自传《解码生命》（A Life Decoded）中所叙述的那样：

在我联系了美国能源部之后的第二天中午，我就已经坐在离坐落于宾夕法尼亚大道的白宫仅仅几个街区之外的一家餐馆里了；而就在那之前的两个小时，我应阿里·帕特里诺斯（Ari Patrinos）的邀请，来参加一个紧急午餐会议。帕特里诺斯在美国能源部生物指挥部工作，他是这项研究的赞助人，他还曾经是白宫组建的第一个人类基因组研究计划所发表的联合声明的主要撰稿人。在参加这次午餐会议的人当中，还有他的领导、能源部科学办公室主任雷蒙德·李·奥巴赫（Raymond Lee Orbach）、总统科学顾问和科学技术政策办公室主任约翰·H.马伯格三世（John H.Marburger III）、白宫国土安全办公室生物恐怖主义、研究和发展部主任劳伦斯·克尔（Lawrence Kerr）。2001年10月，若干封装有炭疽孢子的信件被悄然寄给了公众人物，结果造成5人丧生。在这次事件发生之后，美国政府投入巨资，随时准备应对未来的生物恐怖行动。

我向他们解释了我们是如何利用独创的快速纠错法以前所未有的速度制造出了phiX174的，我还告诉他们，现在我们甚至能够以更快的速度、更容易地制造出更多病毒了。克尔看起来显得忧心忡忡。这次午餐会议最后决定，伴随着合成病毒的创举而来的一些问题必须“向上传达”，即让白宫来确定我们的结果公布发表所必须要满足的潜在限制条件。

事实上，早在十多年前，我就已经敦促过政府尽快审查这一问题了。当时我的研究团队（后来搬到了美国国家卫生研究院）曾经根据卫生部部长的要求，承担了天花病毒基因组的测序工作，这项工作是履行一个国际条约的需要，该条约规定，必须彻底销毁保留在亚特兰大疾病控制中心以及莫斯科的一个安全机构（苏联国家病毒和生物技术研究中心）的天花病毒。是否要彻底销毁“残留”下来的天花病毒，是近几十年来全球公共卫生领域里争论最激烈的问题之一。我们希望做到的是，在这种病毒被彻底销毁之前，它的基因组就已经完成了测序，这样我们就能够把一些重要的科学信息保存下来。正如我在《解码生命》一书中所详细描述的那样，测序工作开始于我在美国国家卫生研究院的实验室，最终完成于基因组研究所。当我们开始分析天花病毒基因组的时候，有几个问题引起了我们的关注。

第一个问题是，政府是否允许，或者说，是否应该允许我们公布我们的测序和分析结果。把这方面的信息公之于众真的可以吗？我们对这个问题的担忧是可以理解的：天花病毒曾经造成数以百万计的人类丧生。在艾滋病病毒流行之前，人类历史上因天花病毒而死亡的人数比因其他传染病而致死的所有人的总和还要多。通常认为，天花起源于3 000多年前的印度和埃及，在历史上，它一而再、再而三地卷土重来，横扫所有大洲，致死率高达到所有感染人数的30%。被感染者即使幸存下来，也要么毁容，要么致盲。天花还被认为是消灭绝大部分美洲原住民的罪魁祸首，据说，欧洲殖民者故意把带有天花病毒的毯子送给当地的土著居民使用，从而使这种疾病在美洲新大陆上广泛传播开来。天花还夺走了无数国王（沙皇、皇帝）和皇后的性命，它已经改变了历史的进程。

最后，我参加了一个专家小组，这个小组的其他成员包括，美国国家卫生研究院院长伯娜丁·希利（Bernadine Healy）以及来自包括国防部在内的各个政府机构的政府官员。这个小组在位于贝塞斯达的美国国家卫生研究院内开会讨论这个问题。所有人都对公开发表天花基因组数据表示担忧，当然这种情绪是完全可以理解的；讨论中甚至还出现了一些更加极端的建议，包括把我的研究成果列入“绝密”，并在我创办的研究机构的大楼周围建一个安全护栏，等等。然而不幸的是，关于制定一个深思熟虑的长期战略的讨论却没有取得什么进展。相反，最后被采纳的一些政策都是由冷战时期的政治所决定的。作为与苏联所签订的条约的一部分，苏联要完成一条次要的天花DNA链的测序，而我们测序的则是一条主要的链。了解到苏联正准备公开他们的基因组数据，美国政府就催促我们加速推进研究进程，尽快完成测序工作，保证抢在苏联人之前率先公布结果。这样一来，也就给这些有意义的讨论画上了句号。

幸运的是，与当年考虑天花病毒数据是否公开时所采取的“应急措施”不同，这一次，白宫（时任总统是布什）非常仔细地审查了我们合成病毒工作的影响。经过广泛的磋商和研究之后，他们最终决定支持公开发布我们合成phiX174基因组的成果和相关方法，这让我很欣慰。我们是幸运的，因为我们研究的第一阶段所需的部分资金本来就是政府的拨款，这就确保了有关的监管部门能够快速做出反应。我很清楚，如果没有公开的讨论和政府的主动审查，我们的研究就很可能会由于有关方面因当时的社会氛围而下意识做出的政策反应而终止，因为当时正值“9·11”恐怖袭击事件发生不久，再加上威默的脊髓灰质炎病毒也刚刚公布，整个美国风声鹤唳，民众心理极为恐慌，在这种环境下，要做出冷静而清晰的逻辑分析是很困难的。最后，这项研究成果被发表在2003年12月23日出版的《美国国家科学院院刊》上。政府规定，这类成果公开发表的一个条件是（这也是我所赞成的）成立一个由多个相关政府机构的代表组成的一个委员会，专门关注一些有双重用途的生物技术，现在这个委员会是美国国家生物安全科学顾问委员会。

我们在华盛顿特区举行了新闻发布会，并在美国能源部的总部召开了研讨会。在谈到这篇论文时，能源部部长斯宾塞·亚伯拉罕（Spencer Abraham）称赞道，我们这个成果“简直令人吃惊”，亚伯拉罕预测，它可能会导致一些“量身定制”的微生物出现：它们能够用来处理污染物，或者吸收多余的二氧化碳，甚至可以满足未来的燃料需求。这对我是非常大的鼓励，当这些想法变成现实的时候，那将是我们为整个社会做出的重大贡献。我们现在已经有能力构建合成基因组了，我确实盼望着，这种技术将会促成一个非同寻常的进步，使我们有能力设计出一些能够解决许多重要的能源和环境问题的微生物。比如说，可以设计一些微生物，用它们来把阳光转化为燃料；还可以设计另一些微生物，用它们来“吞噬”、分解固体污染物或吸收、转化二氧化碳等废气。

我们重做了科恩伯格在20世纪60年代就已经获得成功的利用DNA聚合酶复制phiX174基因组的实验（尽管当时人们对phiX174基因组的了解还不深），不过我们这次用的是合成DNA。这些成果证明DNA代码中已经包含制造病毒必要的和充分的信息。总之，我们通过合成找到了一切所需的证据。由于准确地制造出了大小为5 000个碱基对的DNA片段，我们现在可以肯定，在DNA合成方面我们已经解决了关键性问题，我们能够进行下一步行动了。我们现在准备尝试去做以前从来没有人做过的事情，那就是，去创造一个完整的细菌的合成基因组，并且试图制造出第一个人造细胞。不过，当时我们并没有意识到，为了做成这件事，我们又花了整整七年的时间。

伦理问题

然而，就是在那个时候，我们已经清楚地意识到，如果在计算机里设计生命代码获得成功，并且通过化学合成把它翻译成DNA软件，然后把这些合成的代码放到一起创造出一个新的生命体，那么就意味着活力论真的寿终正寝了。由此而带来的一个必然结果是，我们已经拥有了一个清晰的图像，能够说明“生命”这个术语到底是什么意思。机械的数字世界与生物学的融合将为创造新的物种和引导未来的演化开启一扇前所未有的发展潜力之门。我们已经完成了非常重要的一个步骤，我们已经走进了“影响一切可能事物”的开端，我们能够真正实现弗朗西斯·培根所描述的建立对自然界的“统治权”。然而，伴随着这个伟大的力量而来的是我们的义务，即我们必须解释清楚我们的目的——只有这样，全社会才能够理解它——而且更为重要的是，我们必须要负责任地使用这种力量。

在我们创造合成基因组的努力最终取得成功很久之前，我迫切想要开展一个有关这一成就“对科学和社会可能意味着什么”的全面的伦理评估。我确信，有些人可能会认为合成生命是一种威胁（有人甚至认为它是“令人恐惧”的）。他们不知道，这将对人性、健康以及环境造成什么样的影响。作为我的研究所承担的“教育工作”的一部分，我在华盛顿特区的国家科学院组织了一系列名家研讨会。顾名思义，这些名家研讨会的一个特点就是，参与者当中有许多都是著名人物，例如，其中就有贾雷德·戴蒙德、悉尼·布伦纳等人。由于我对生物伦理学问题感兴趣，我还邀请了亚瑟·卡普兰（Arthur Caplan）发表了一个演讲，他当时在宾夕法尼亚大学生物伦理学中心工作。在卫生保健和伦理道德方面，卡普兰一直是一个非常有影响力的人物，与其他演讲者一样，在亚瑟·卡普兰的演讲结束后，我邀请他一起共进晚餐。在晚餐期间，我谈到，由于当代的许多生物医学问题牵涉面都很广，因此他在自己职业生涯的这个阶段必定已经听说过其中一些问题了。卡普兰回答说，是的，他的确已经听到过这方面的一些问题了。不过，当被问及他是否曾经考虑“如何评估在实验室里创造新的合成生命形式”这个问题时，他看起来非常惊讶，他承认在我提出来之前他绝对没有听说过这个话题。我又问他，如果我给他的研究团队提供必要的资金，他会对进行这种评估感兴趣吗？卡普兰很兴奋，他对参与我们的合成生命项目非常感兴趣。随后，我们达成一个协议，我的研究所将给他的研究团队提供资金，而他的研究团队（宾夕法尼亚大学生物伦理学中心伦理研究小组）将会完全独立地评估我们“创造一个合成细胞”这个努力将会造成怎样的影响。

卡普兰和他的研究团队组织了一系列研讨会，邀请了很多专家、宗教领袖以及普通人参加，他们还完成了大量的访谈。在其中一个环节，我也应邀参加会议，向与会者讲解了我们采取的研究方法、阐释了我们设想的目标，并回答了与会者提出的一些问题。在那次会议中，我发现我自己就坐在几个非常重要的宗教界代表旁边。会议上的讨论似乎表明，宗教界代表并不能在《圣经》或其他宗教经典中找到具体的依据来禁止创造新的生命形式这种做法，因此创造新的生命形式这种做法应该是可以接受的。对此，我感到有些震惊，当然也非常高兴。

直到由米尔德里德·K.赵（Mildred K.Cho）、戴维·马格纳斯（David Magnus）、亚瑟·卡普兰、丹尼尔·麦吉（Daniel McGee）和基因组学伦理小组合著的一篇题为《合成一个最小基因组的伦理考量》（Ethical Considerations in Synthesizing a Minimal Genome）的论文发表在《科学》杂志上那一天为止，我再也没有听到过有关宾夕法尼亚大学生物伦理学研究的消息。巧合的是，我自己的研究成果同样被发表在1999年的12月10日出版的同一期《科学》杂志里，论文的题目为《总体转座因子突变和最小支原体基因组》（Global Transposon Mutagenesis and a Minimal Mycoplasma Genome），这篇论文描述的是我们如何使用转座因子来确定哪些基因对生命是至关重要的。伦理学那篇论文的作者们热情洋溢地赞誉了我们的工作，说这是通向基因工程的重要一步，它使我们能够在“只知道它们的基因组序列时，就可以创造出生物体（新的和现有的）”。

这篇论文在一开头就指出，1997年2月，科学家突然宣布，克隆羊“多利”已经来到了我们生活的这个地球上，这提出了一个问题：面对着这种超出原来伦理和法律范围的科学进步，我们应该怎么做？“多利”实际上并不是第一个被克隆出来的动物，不过它是第一个从一个成年的动物细胞中克隆出来的动物。这个消息震惊了所有的生物学家，因为几乎没有人会认为存在着这种可能性：取出一个已经分化了的成年动物细胞，然后反转发育时钟，创造出一个能够再次生长发育成一只动物的细胞。当然，“捐献”出乳腺细胞、让科学家创造出“多利”的那只绵羊并没有像一些人所声称的那样“死而复生”，复活的只是它的DNA软件。

正如我所希望的那样，随着最小的基因组被“创造”出来，有关伦理问题开始浮出水面，而宾夕法尼亚大学伦理研究小组从一开始就掌握了主动权。在我看来，这一点是特别重要的，因为在这种情况下，带来前瞻性的问题、引导讨论深入的是我们这些参加基础研究、提出推动科学进步构想的科学家，而不是满腔怒火、心怀戒备或忧心忡忡的普通民众，也不是那些宣称我们必须咨询他们的组织（虽然一些边缘化的组织后来这样宣称了）。那篇伦理学的论文的作者们还指出，尽管妖魔化我们的工作的诱惑非常大（很可能是无法抗拒的），但是“科学界和公众应该能够理解，现在最紧要的事情是努力去确定这类科学研究的性质，并搞清楚它所涉及的关键伦理问题、宗教问题和形而上学问题究竟有哪些，只有这样，有关的争论才有可能快速跟上科学发展的步伐。伦理之所以会落后于这个领域的科学进步，唯一的原因只能是，我们自己允许出现这样的情况”。

那篇文章接下去还探讨了其他各种各样的问题，包括由于新的物种出现而带来的潜在环境风险、专利方面的问题等。不过，论述安全问题的这个关键段落很大程度上在媒体的报道中被忽略了（当然，这很可能是因为人们认为合成基因组这种事情是属于非常遥远的未来的）：“危险在于，如果人们掌握了一些可能会对公众健康和安全造成威胁的极端致命的病原体的序列，那就有可能弊大于利了。然而令人不安的是，对于这些技术，目前所能提供的监管方式实在是太少了。”

考虑到围绕消灭天花病毒展开的争论和对脊髓灰质炎病毒的扩散的担忧，或许还可能预期到了流感病毒大暴发时世界各地的人们束手无策的窘状，宾夕法尼亚大学伦理研究小组曾经提出过这样一个问题：我们是否应该对科学研究进行监管？如果应该，那么应该监管到何种程度？这个问题将会主导下一代合成基因组学的研究。

尽管那篇论文是发表在综合性的科学期刊《科学》杂志上的，但是奇怪的是，它却花了很大的篇幅去思考有关“生命的起源和生命的意义”的还原主义科学思想的影响，而没有真正花大力气去阐释由小小的四个字母所组成的这个单词“生命”（life）所包含的真正意义。当然，这是一个棘手的问题。作者们警告道：

如果最小基因组的识别和合成这一成果，被科学家们阐释为、被媒体描述为、被公众理解为证明生命可被还原成DNA或者干脆就等于DNA的话，那就会构成一个严重的威胁……这将会威胁到“生命是特殊的”这一观点。至少从亚里士多德以来，我们人类就存在一个传统，即认为生命不仅仅是物质的。这为以下这种信念提供了基础：天下万物都是相互联系着的，在一个非常重要的意义上来说，生命的意义不仅仅在于把各种物质组织起来。

好像是为了强调他们对这件事情的焦虑感似的，米尔德里德·K.赵以及其他作者也对宗教问题给予了过多的关注：“令人惊讶的是，主要的西方宗教团体几乎从来没有试图给出过生命的准确定义，也没有描述过生命的真谛究竟是什么。”因此这个责任便留给了科学，作者们得出结论，一个“有关生命的纯粹的科学定义”难免会引起人们的担忧。

根据宾夕法尼亚大学伦理研究小组的说法，最紧迫的问题在于，必须确定“这类研究是否构成了对大自然中最好留给大自然自己去解决的事务的‘未经授权的介入’”。这项研究的一个重要的研究结果呼应了我在早期的一些讨论中曾经听到过的一种观点，“占主导地位的宗教观点是，虽然我们有许多理由保持谨慎，但是创造一个最小基因组这个研究议程不会因为合理的宗教因素而被自动地终止”。

然而，这并不意味着宗教因素是无关紧要的。一个极端的观点是，我们的工作标志着人类的进步。而另一个极端的观点则是，这仅仅是“自以为是的科学”的一个最新的例子，它将不可避免地导致灾难的发生——这个主题曾经在通俗文学中被一而再、再而三地描述和探讨过，从玛丽·雪莱的《弗兰肯斯坦》中的怪物，到H.G.威尔斯（H.G.Wells）的《拦截人魔岛》（The Island of Doctor Moreau）中的兽人，再到迈克尔·克莱顿（Michael Crichton）的《侏罗纪公园》（Jurassic Park）中的复活的恐龙，等等。

在11年后，当我们宣布第一个合成细胞已经诞生时，上述这一个问题再次占据整个媒体界。它们集体一致的反应是：我们是不是在“扮演上帝的角色”呢？宾夕法尼亚大学伦理研究小组的那篇论文非常明智地指出，在我们关于操纵生命应该承担的伦理道德责任的讨论中，这种反对意见已经变成一种阻止讨论正常展开的手段，而不是促进讨论深入的方法。那篇论文认为，在前述两个各执一端的立场——一个极端是，认为这只是“自以为是的科学的又一个例子”的悲观主义论调，另一个极端是，认为这可以视同于“人类的进步”的乐观主义观点——之间，我们有可能取得平衡。作者还补充说，一个“好的管家”将会谨慎地推动基因组研究，因为他拥有关于新知识的恰当目的和用途的深刻洞见。他们得出结论，只要研究者们继续参与公开讨论，就不存在任何强烈的伦理理由去阻止他们继续在这个领域进行研究。当然，我们一直在参与公开讨论。