褐煤精华液的制备及其对小麦种子萌发的影响

褐煤精华液的制备及其对小麦种子萌发的影响_2013年论文集

褐煤精华液的制备及其对小麦种子萌发的影响

秦　谊1　马领弟1　朱　辉1　张惠芬2　何　静1　李　顺1　李宝才1

(1　昆明理工大学生命科学与技术学院　昆明　650500　2　昆明理工大学化学工程学院　昆明　650500)

摘　要：本研究制备了一种褐煤精华液(Brown Coal Distillate, BCD)，并以小麦为实验材料，通过测定种子发芽率、胚芽相对伸长速率和胚芽胚根的长度、鲜重、干重等生理指标及渗透调节有机物质脯氨酸、可溶性糖的含量，分析BCD处理对小麦种子萌发的影响。结果表明，在非盐胁迫下，各BCD处理组相较于空白对照组，种子发芽率均有所上升；胚芽和胚根的长度、胚芽脯氨酸含量有所上升，且BCD浓度为10‰时升高显著(P＜0.05)。在盐胁迫下，各BCD处理组相较于模型对照组，种子发芽率也均有所上升；胚芽的长度和脯氨酸含量有所上升，且BCD浓度为40‰时升高显著(P＜0.05)。因此，适宜浓度的BCD能促进非盐胁迫下小麦种子的萌发及生长，并且能显著地缓解盐胁迫下种子受到的萌发及生长抑制。

关键词: 褐煤；褐煤精华液；黄腐酸；小麦；盐胁迫

The Preparation of Brown Coal Distillate and Its Effect on the Germination of Wheat

Qin Yi1, Ma Lingdi1, Zhu Hui1, Zhang Huifen2, He Jing1, Li Shun1, Li Baocai1

(1 Faculty of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming, 650500 2 Faculty of Chemical Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming, 650500)

Abstract: In this study, a brown coal distillate (BCD) was prepared.With wheat as the experimental material, the germination rate, relative elongation rate of germ, the length, fresh weight and dry weight of embryo and radicle, and the content of praline and soluble sugar were determined to investigate the influence of BCD on the germination of wheat seeds.The results showed that, under the non-salt stress, BCD treatment compared to Control Check 1 treatment, the germination rate raised and the length of embryo and radicle, the content of proline in the embryo increased significantly(P＜0.05) when the concentration of BCD was 10‰; Under the salt stress, BCD treatment compared to Control Check 2 treatment, the germination rate also raised and the length of bud and the content of proline in the embryo increased significantly(P＜0.05) when the concentration of BCD was 40‰.Therefore, suitable concentration of BCD could not only promote the germination of wheat seeds under non-salt stress, but also relieve the inhibiting of salt stress on the germination of wheat seeds.

Key words: brown coal; brown coal distillate; fulvic acids; wheat; salt stress

一般认为，黄腐酸(Fulvic Acid, FA)是腐植酸类物质中分子量最小、溶解度最高、生物活性也最强的部分，其含活性官能团多，易被生物体吸收利用[1]。大量研究表明，黄腐酸具有抗盐、抗旱、调节植物生长等诸多植物生理活性[2～4]。

本课题组长期从事黄腐酸化学组成和生物活性的研究[5～8]，在通过过氧化氢氧化降解褐煤的方法制取黄腐酸过程中得到一种无色透明的蒸馏液，该溶液pH值为2～3，密度为1.02～1.05 g/ cm3，分子量小于500(HPLC-MS测定)。初步活性筛选发现，该溶液具有比黄腐酸更强的缓解盐胁迫对小麦种子萌发抑制作用的活性，同时在非盐胁迫下也具有明显的提高种子发芽率和促进胚芽胚根生长的作用。我们将这种无色透明的溶液命名为褐煤精华液(Brown Coal Distillate, BCD)。

本研究通过测定BCD处理过的小麦种子的发芽率、胚芽的相对伸长速率和胚芽胚根的下及非盐胁迫下小麦种子萌发的影响。通过对BCD抗盐胁迫活性的研究，以期发现一类新的抗盐活性物质，为小麦抗盐胁迫研究提供理论基础，也为植物抗盐碱高级肥料的开发及盐碱耕地的合理、有效利用提供技术支持。

1　材料与方法

1.1　材料

褐煤采自云南峨山县小棚租煤矿，干燥后粉碎，过80目筛，进行理化性质分析。供试种子为小麦种“烟农19号”，系烟台市农业科学院小麦研究所以“烟1933”为母本，“陕82-29”为父本进行杂交选育。改良的Hoagland’，s培养液：参照文献[9]配制。

表1　原料煤主要理化性质
Tab.1 The main physical and chemical properties of the raw coal

1.2　BCD的制备

将1 kg褐煤置于反应容器中，加入浓度为15%的H2O2溶液2 L，适量负催化剂和稳定剂，连续搅拌3 h，温度控制在35℃。待氧化反应完成后，将产物离心10 min(转速4000 r/min)，过滤后的上清液即为黄腐酸溶液。将黄腐酸溶液置于旋转蒸发仪中，在50℃下抽真空旋蒸。旋蒸完成后得到的固体物质为黄腐酸粗品[5]。冷凝下来的无色透明的蒸馏液即为褐煤精华液，测定pH值为2.5，密度为1.04 g/cm3。用蒸馏水将BCD分别稀释为原浓度的1‰、5‰、10‰、15‰、20‰、30‰、40‰、50‰备用。

1.3　种子的致敏及萌发

取籽粒饱满的种子用自来水漂洗，经10% NaClO消毒10 min后用无菌蒸馏水冲洗七次。蒸馏水和不同浓度的BCD作为致敏液将小麦种子浸泡12 h进行致敏，共9批。取同批致敏一致的种子150粒，整齐摆放到3个直径为12 cm的培养皿中(铺有1层滤纸)，每皿50粒，各加入10 mL Hoagland’s培养液。其中，用蒸馏水致敏的空白对照组(Control Check1, CK1)和1‰、5‰、10‰、15‰、20‰ BCD组不加NaCl；用蒸馏水致敏的模型对照组(Control Check2，CK2)和10‰、20‰、30‰、40‰、50‰ BCD组分别培养在NaCl浓度为125 mmol/L(盐敏感临界浓度)的改良Hoagland’s培养液中；共12组。用恒温培养箱进行培养，昼夜温度分别保持在16～26 ℃和10～16 ℃，平均光周期为14 h。每天用称重法在培养皿中注水补充蒸发失去的水分，保证盐浓度的恒定。

1.4　测定指标

1.4.1　发芽率及胚芽、胚根长度的测定

种子胚根突破种皮作为种子发芽的标准。分别在培养12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h后从各组随机取12颗发芽种子测定芽长和根长，计算胚芽的相对伸长速率(Relative Elongation Rate, RER)。RER= L2- L1/Δt，式中L2为后一次的测量值(mm)，L1为前一次的测量值(mm)，Δt为时间间隔(h)。72 h后同时计算发芽率，发芽率=发芽种子数/供试种子数×100%。

1.4.2　胚芽、胚根鲜重和干重的测定

在培养72 h后从各组随机选取发芽种子测定胚芽、胚根鲜重和干重。用蒸馏水清洗胚芽和胚根，并用滤纸擦干，用电子天平称取鲜重后，装于纸质口袋中，置于70 ℃烘箱中至恒重后称其干重。

1.4.3　胚芽有机小分子物质含量的测定

在培养72 h后从各组随机选取发芽种子参照文献[10]的方法测定胚芽中脯氨酸和可溶性糖的含量。

2　结果与分析

2.1　小麦种子盐敏感临界浓度的确定

由图1可知，相较于CK1处理，低浓度NaCl(50 mmol/L)处理小麦种子发芽率变化较小,而高浓度NaCl(≥150 mmol/L)处理时发芽率下降迅速，降至20%以下。我们选择中间浓度125 mmol/L继续进行试验，发现该浓度下发芽率为51.6%，为较佳的盐处理浓度，称该浓度为小麦种子的盐敏感临界浓度。

图1　不同浓度NaCl处理对小麦种子发芽率的影响

Fig.1 Effects of NaCl treatments of different concentration on the germination of wheat

2.2　BCD对小麦胚芽RER的影响

由图2可知，CK1组胚芽RER最大值出现在第48 h，CK2组RER最大值推后，出现在第60 h，且约为CK1组的三分之二，表明盐胁迫下胚芽的伸长受到明显抑制。在非盐胁迫下，1‰、5‰、10‰、15‰ BCD处理组相较于CK1组RER逐渐增加，20‰ BCD组有所降低，且10‰BCD组的RER最大值出现的时间提前到第36 h。在盐胁迫下，10‰、20‰、30‰、40‰ BCD处理组相较于CK2组RER逐渐增加，50‰ BCD组有所降低，且40‰BCD组的RER最大值出现的时间提前到第48 h。由此可见，BCD不仅能促进非盐胁迫下胚芽的伸长，而且还可以缓解盐胁迫对胚芽伸长的抑制作用。

图2　不同处理下小麦种子胚芽相对伸长速率

Fig.2 Relative elongation rate of germ under different treatments
注：图中CK1、CK2分别表示空白对照组和模型对照组，10‰BCD-CK1和40‰BCD-CK2分别表示非盐胁迫下10‰ BCD处理和盐胁迫下40‰ BCD处理。

2.3　BCD处理对小麦发芽率、胚芽和胚根长度的影响　

从图3A可以看出，非盐胁迫下，同对照组相比大部分BCD处理组种子发芽率均有所上升，但无显著性差异；盐胁迫下，同对照组相比大部分BCD处理组发芽率也有所上升，但同样无显著性差异。从图3B可以看出(培养72 h后)，BCD处理对盐胁迫下和非盐胁迫下芽长、根长的影响趋势与其对发芽率的影响大概相同；但非盐胁迫下10‰BCD组同对照组相比，芽长、根长均显著增长(P﹤0.05)，盐胁迫下40‰ BCD组同对照组相比，芽长显著增长(P﹤0.05)。以上分析表明，BCD处理可以提高非盐胁迫下和盐胁迫下小麦种子的发芽率，并能显著促进胚芽、胚根的伸长。

2.4　BCD处理对小麦胚芽和胚根鲜重、干重的影响

从图4 A可以看出，非盐胁迫下，同对照组相比大部分BCD处理组种子胚芽、胚根的鲜重均有所增加，其中10‰ BCD组增加幅度最大，但无显著性差异；盐胁迫下，同对照组相比大部分BCD处理组胚芽、胚根的鲜重也有所增加，其中40‰BCD组增加幅度最大，但同样无显著性差异。从图4B可以看出，BCD处理对盐胁迫下和非盐胁迫下胚芽、胚根干重的影响趋势与其对鲜重的影响大概相同。以上分析表明，BCD处理可以增加非盐胁迫下和盐胁迫下小麦种子胚芽、胚根的鲜重和干重。

图3　非盐胁迫下和125　mmol/L　NaCl胁迫下不同浓度BCD处理对小麦发芽率(A)、芽长和根长(B)的影响

Fig.3 Effects of BCD treatments on the germination rate(A), length(B) of shoot or root when there is no salt or 125mmol/L NaCl stress
注：与CK1相比，a P＜0.05；与CK2相比，b P＜0.05。

图4　非盐胁迫和125mmol/LNaCl胁迫下不同浓度BCD处理对小麦胚芽和胚根鲜重(A)、干重(B)的影响

Fig.4 Effects of BCD treatments on the fresh weight(A), dry weight(B) of shoot or root when there is no salt or 125 mmol/L NaCl stress

2.5　BCD处理对小麦胚芽脯氨酸和可溶性糖含量的影响

从图5 A可以看出，非盐胁迫下，同对照组相比大部分BCD处理组胚芽的脯氨酸含量均有所上升，且10‰ BCD组有显著性差异(P＜0.05)；盐胁迫下，同对照组相比大部分BCD处理组发芽率均有所下降，且40‰ BCD组有显著性差异(P＜ 0.05)，但50‰ BCD组脯氨酸含量又大幅上升。从图5 B可以看出，BCD处理对盐胁迫下和非盐胁迫下胚芽可溶性糖含量的影响趋势与其对脯氨酸含量的影响大概相同；但各处理组与对照组相比均无显著性差异。以上分析表明，非盐胁迫下，BCD处理可以提高胚芽中脯氨酸和可溶性糖的含量；盐胁迫下，BCD处理可以降低胚芽中脯氨酸和可溶性糖的含量，但该作用受浓度的影响显著。

图5　BCD对非盐胁迫和125　mmol/L　NaCl胁迫环境中胚芽脯氨酸(A)和可溶性糖(B)含量的影响

Fig.5 Effects of BCD treatments on the proline(A) and soluble sugar(B) content of shoot when no salt or 125 mmol/L NaCl stress
注：与CK1相比，(a) P＜0.05；与CK2相比，(b) P＜0.05。

3　讨论

很多禾谷类植物实验研究证明，种子萌发的好坏对最终的作物产量有很重要的影响[11,12]。萌发期是禾谷类作物整个生长过程中耐盐性最薄弱的阶段之一，因此提高禾谷类作物萌发期的耐盐性具有重要意义。本实验中BCD处理减缓了盐胁迫对胚芽伸长的抑制作用，将对该小麦品种整个生长发育产生重要影响。

盐胁迫下植物种子的萌发受土壤渗透胁迫的影响显著[13,14]，土壤中盐分过多，使土壤水势降低，植物吸水困难，从而造成细胞缺水，萌发受到抑制[15]，而植物中碳水化合物的积聚有利于渗透调节[16]，植物通过主动增加细胞内溶物质降低细胞渗透势(如CK2处理)，因而能从环境中继续吸收水分，这个过程就是渗透调节作用。盐胁迫下，经BCD处理该小麦品种胚芽体内渗透调节有机物质含量相较于CK2逐渐降低，渗透调节作用逐渐趋于非起效状态，说明发芽种子受到的盐胁迫有所降低，BCD提高了小麦的抗盐性，这不仅保证了盐胁迫下种子较高质量的萌发而且有望提高最终产量。

有研究表明FA克服了Fe从土壤溶液到植物根部扩散的限速步骤，Fe-FA作为肥料的效能远高于FeCl3，对于解决作物中的Fe缺乏有重要的意义[17]。BCD可看做是FA混合物中易挥发的部分，其化合物分子量更小，在植物体中的扩散更有优势，并且本研究预实验结果证实BCD促进植物种子萌发的作用优于FA，因此BCD对Fe及其它离子的转运作用值得进一步研究。植物体一般含有较高水平的抗氧化剂，不管是本身具有的还是外源物质诱导产生的，都会有增强植物抵抗环境胁迫能力的作用[18]，而具有抗氧化活性的FA[19]可能具有缓解盐胁迫下植物质膜氧化损伤的作用[20]，因此在本实验中作为FA较优级分的BCD很有可能充当了小麦抗氧化剂诱导剂。

在本实验中，BCD在极低浓度下表现出促进种子萌发和缓解盐胁迫对小麦生长抑制的作用，由此可见BCD是一个优良的具有抗盐活性的有机混合物质，非常适合开发为抗盐胁迫及调节植物生长的高级肥料，这不仅为小麦抗盐胁迫提供理论支持还可以为合理有效地利用盐碱耕地提供有力的技术支撑。

4　结论

实验结果表明在盐胁迫下和非盐胁迫下，BCD处理均能提高小麦种子的发芽率，同时能调节其它生理指标的变化。在非盐胁迫下，BCD处理后胚芽中游离脯氨酸和可溶性糖的含量逐渐增加，进而促进了种子的萌发，其中以10‰ BCD为最佳；在盐胁迫下，BCD处理后游离脯氨酸和可溶性糖的含量相较于CK2逐渐降低，表现出缓解盐胁迫对小麦种子萌发抑制的作用，提高了小麦的抗盐性，其中以40‰ BCD为最佳。过高浓度的BCD在非盐胁迫下和盐胁迫下均表现出对小麦种子萌发的抑制作用，其中部分原因可能是由于高酸性(pH50‰ BCD＜5)破坏了根细胞的结构与功能，打破了离子平衡，扰乱了细胞代谢，为此植物需要代谢出更多的物质与能量以抵御酸性伤害。因此，选择合适浓度的BCD处理盐胁迫下的小麦，可以缓解盐胁迫对小麦种子萌发阶段的生长抑制作用，这对于提高小麦的最终产量十分重要。同时，由于BCD中多为水溶性小分子混酸物质，易随水蒸气蒸发，较难进行浓缩、萃取及分离，对其化学组成的探索一直是难点。化学组成不清晰会限制BCD活性机理的研究及应用开发，其化学组成将会是今后研究工作的重点。

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[支持项目]本研究由国家自然科学基金项目(21166013)及云南省应用基础研究计划项目(2013FZ025)资助。

中石化启动230亿环保计划

中石化近期已启动“碧水蓝天”环保计划，即在2013年至2015年三年间，将投入近230亿元用于环境治理。这是中石化历史上规模最大的环保治理行动。该计划将突出推进污染物减排与达标排放以及提升作业场所及企业周边环境质量，包括油气回收、异味治理、无组织排放源挥发性有机物检测与控制、噪声治理等，同时将积极治理环保隐患，包括环境风险防控、地下水污染防控、废渣处理、生态保护及固废处置中心建设等。

(来源：2013年11月4日《经济日报》)