腐植酸在褐鳟鱼鳃和肌肉抵抗镉中毒的组织病理学和生物化学作用

腐植酸在褐鳟鱼鳃和肌肉抵抗镉中毒的组织病理学和生物化学作用_2013年论文集

腐植酸在褐鳟鱼鳃和肌肉抵抗镉中毒的组织病理学和生物化学作用

Gonca Alak1, Muhammed Atamanalp2, Ahmet Topal2, Harun Arslan2, Ertan Oruç3, Serdar Altun3 著

李　双4　译

(1　阿塔特克大学农学系　埃尔祖鲁姆　土耳其　25240　2　阿塔特克大学渔业系　埃尔祖鲁姆　土耳其　25240　3　阿塔特克大学兽医系　埃尔祖鲁姆　土耳其　25240　4　中国腐植酸工业协会　北京　100120）

摘　要：为了探究腐植酸对褐鳟鳃和肌肉在抵抗镉(Cd)中毒方面是否发挥积极作用，进行了组织病理学和生物化学方面的研究。试验中，褐鳟暴露在仅施加2 ppm镉，2 ppm镉加5 ppm腐植酸，仅含5 ppm腐植酸的三种环境条件下，分别测定其鳃和肌肉组织的谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)水平。在含镉条件下，褐鳟组织中的GPx和SOD活性明显低于对照组(P<0.05)，而含镉环境中褐鳟组织的MDA并未升高(P>0.05)。然而，腐植酸并未影响镉造成的生化伤害。镉对鳃和肌肉组织造成明显的组织病理变化，而在Cd+HA组中，这种变化较小。这些结果表明，腐植酸可能从组织病理学方面能中和镉中毒。

关键词：毒性　抗氧化酶　褐鳟　组织病理学　腐植酸

Histopathological and Biochemical Effects of Humic Acid Against Cadmium Toxicity in Brown Trout Gills and Muscles

Gonca Alak1,*, Muhammed Atamanalp2, Ahmet Topal2, Harun Arslan2, Ertan Oruç3, Serdar Altun3 write Li Shuang4 translate

(1 Ataturk University, Agriculture Faculty, Erzurum, Turkey, 25240 2 Ataturk University, Fisheries Faculty, Erzurum, Turkey, 25240 3 Ataturk University, Veterinary Faculty, Erzurum, Turkey, 25240 4 China Humic Acid Industry Association, Beijing, 100120)

Abstract: It was biochemically and histopathologically investigated whether humic acid (HA) has protective effects on cadmium (Cd) toxicity on muscle and gills of brown trout.The brown trout were exposed to cadmium (2 ppm) and/or humic acid (5 ppm).For this purpose, levels of glutathione peroxidase (GPx), superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA) was investigated in muscle and gills tissues of brown trout.The activities of GPx and SOD in the tissues of fish exposed to Cd was significantly lower than the control groups (P<0.05).MDA levels did not increase in the groups exposed to cadmium (P>0.05).Hovewer, humic acid did not affect biochemical damage in cadmium group.Cd caused a significant increase in histopathological changes in muscle and gills tissues, but histopathological changes were lower in the muscle tissue of Cd+HA group.These results suggest that humic acid may counteract the cadmium toxicity in muscles tissue in histopathologic aspect.

Key words: toxicity; antioxidant enzyme; brown trout; histopathology; humic acid

镉是一种毒性很强的重金属元素，从上世纪起，它在大气、水、土壤和植物中的浓度呈升高趋势。由食物或水进入水生动物后，镉与血液中的白蛋白和红细胞结合而进一步转移到组织和器官。通过诱导金属硫蛋白mRNA的合成，形成小分子量的金属硫蛋白。镉在生物体中的富集是一个值得关注的重要的生态学问题，尤其是其富集作用发生的非常快。镉能造成鱼类各器官结构和病理形态学的变化。鱼的肾脏和肝脏是发现含镉量最高的地方。

近年来，特定酶系统和不同药物，金属离子和化学药品之间的互作都有广泛的研究。许多环境污染物会引起水生动物的氧化应激反应。化学有毒污染物是生物系统活性氧的重要来源，会抑制抗氧化防御系统中一些酶的活性。在环境毒理学和生态毒理学已经初步形成了氧化应激反应和对基础生物分子的伤害以及器官的抗氧化防御系统的研究领域。抗氧化酶如内源谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱苷肽S-转移酶(GST)和过氧化氢酶(CAT)能降低会造成组织伤害的活性氧含量。

腐植酸在环境中普遍存在，并发现它可以影响水生生物的生理功能。在欧洲兽医实践中，腐植酸已被用作止泻剂，镇痛剂，免疫刺激，抗菌剂。有文章表明，在不同动物物种中，通过一些生理变化和免疫的形成，腐植酸与生长和健康防护能力有很大关联。

本研究目的是为了调查腐植酸在褐鳟鱼抵御镉伤害过程中可能起到的保护作用。毒性评估依据组织病理学，对肌肉和鱼鳃组织中抗氧化物GPx、SOD和MDA水平进行了测定。

1　材料和方法

1.1　试验设计

褐鳟，又名亚东鲑，由阿塔特克大学渔业和内河鱼类育种研究中心获得。该研究在鱼毒理学实验室并在遵守批准的伦理规则前提下开展。为了让其适应环境条件，褐鳟在池塘内预喂养15 d。过了适应期后，10条褐鳟被放入400 lt体积的玻璃水箱中。用来测试的褐鳟鱼平均重量为203.31±8.09 g，身长为22.21±0.49 cm。水箱水的理化性质为：温度(10～12 ℃)；pH(7.4～ 8.0)；溶氧量(7.52±0.50 ppm)；水硬度CaCO3含量(164.1±4.17 ppm)。腐植酸购于Farmavet医学公司。配制一定浓度氯化镉(Sigma)和腐植酸原液。原液中Cd和腐植酸的浓度分别为2 ppm，5 ppm。

褐鳟鱼被分为4组。第一组为对照组，第二组为含镉组，第三组为腐植酸组，第四组为镉+腐植酸组，每组有10条。给第二组鱼单次施于剂量为浓度2 ppm的氯化镉。这个剂量为前人研究中对彩虹鳟造成毒性剂量值。第三组鱼的腐植酸单次施于剂量为5 ppm。第四组鱼被施于2 ppm镉和5 ppm腐植酸的混合液。鱼类在含不同剂量的环境中维持7 d。

1.2　生化分析

根据Alak等的方法，分析出褐鳟不同组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)，超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。在Wiegand等的方法上进行改良，获得每个个体的各个组织的提取物。将组织浸入液氮，用研钵研磨。研磨后放入KH2PO4(30 mM，pH=7.3)缓冲液中混匀成匀浆。匀浆在4 ℃下，13000 rpm离心2 h后取上清用来测定酶活，用蛋白含量表示。鱼的组织中MDA含量按照Gülcin等的方法测定。加入200 μL溶血产物，800 μL磷酸盐缓冲液(50 mM，pH7.4)，25 μLBHT和500 μL浓度30%的TCA，迅速混匀，-20 ℃放置2 h后，2000 rmp离心15 min，分离1.0 mL上清，分别加入75 μL EDTA-Na2 H2O，250μL TBA，之后放入沸水浴15 min，冷却至室温，在532 nm条件下测定和计算出MDA的含量。全部硫代巴比妥酸反应物质用MDA显示。根据Bradford的方法，每份匀浆的1.56×105 cm-1M-1蛋白含量的MDA的摩尔消光系数用Coomassie Brilliant Blue G-250测定，并以牛血清白蛋白作为标样。

1.3　组织病理学检测

用于光学显微镜检测的组织样本先在10%福尔马林中固定24 h，在不同浓度的酒精下脱水后用二甲苯清洗干净，样本埋入融化的石蜡中，用薄片切片机(Leica,Germany)切成块。每个蜡块连续切成5 um后的薄片。石蜡薄片在苏木精-伊红(H-E)中染色后，在光学显微镜下观察(Olympus BX52 with DP72 camera system)。所有组织病理学改变用图像处理系统评估(Olympus, DP2-BSW)。光学显微镜检测结果用半定量的方法评估，评价如下：无病变(-)，轻度病变(+)，中度病变(++)，和重度病变(+++)。

1.4　数据分析

所有数据用平均值±标准差表示。用单因素方差分析法(ANOVA)和Duncan检验对数据进行分析。P＜0.05的数据被视作差异显著。数据使用SPSS 10.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)软件处理。

2　试验结果

2.1　生化结果

与对照组相比，镉的施加使得鱼类肌肉和鱼鳃组织中SOD和GPx水平的显著降低(P＜0.05)，见表1、表2。施加腐植酸和镉并没有使鱼类肌肉和鱼鳃组织中SOD和GPx水平有明显升高。镉处理后，褐鳟肌肉和鱼鳃组织中MDA数据并未显著增加(P＞0.05)。同时也发现，与对照组数值相比，褐鳟鱼鳃组织中MDA活性并没有显著富集。

表1　腐植酸(HA)施加对含镉和不含镉鱼类肌肉组织中GPx,SOD活性MDA水平的影响
Tab.1 The effects on GPx, SOD activity and MDA levels in the muscle tissue of humic acid (HA) administration to fishes with or without cadmium (Cd)

注：所有的值为8个独立测量值的平均值±标准偏差。不同上标字母代表数据的差异显著性(P﹤0.05)

表2　腐植酸(HA)施加对含镉和不含镉鱼类鳃组织中GPx，SOD　活性　MDA　水平的影响
Tab.2 The effects on GPx，SOD activity and MDA levels in the gill tissue of humic acid (HA) administration to fishes with or without cadmium (Cd)

注：所有的值为8个独立测量值的平均值±标准偏差。不同上标字母代表数据的差异显著性(P﹤0.05)

2.2　组织病理学结果

对照组中的肌肉(图1a)和鱼鳃组织(图2a)没有任何病理学的变化；腐植酸组(图1b和2b)同样也没有发现病理性变化；在试验镉处理组发现有明显变化。

在镉处理组中，发现鱼鳃组织的水样变质，空泡性恶化，第二层腮瓣上皮细胞增生和第二层腮瓣的破坏(图1c)。另外，在镉处理组的肌肉组织中，发现缝隙有单核细胞的侵入。同时施加镉和腐植酸试验组也发现类似的病理学变化。在该组的肌肉组织中，血管堵塞，细胞衰退，脱皮(图2d)。病理变化的严重程度见表3。

图1　对照组(a)和腐植酸组(b)鳃组织正常组织学表现

Fig.1 Normal histologic appearance of gill tissue in control (a) and HA (b) groups
注：含镉组鳃上皮细胞的严重变性和脱落(c-箭头)；含镉+腐植酸组有类似的上皮细胞丢失(d-箭头)，含镉+腐植酸组有许多充血血管(*)。

图2　对照组(a)和腐植酸组(b)肌肉组织正常组织学表现

Fig.2 Normal histologic appearance of muscle tissue in control (a) and HA (b) groups
注：含镉组鳃出现炎症单核细胞侵入(c-箭头)；含镉+腐植酸组没有炎症细胞(d-箭头)。

表3　鳃和肌肉组织中病理学变化的严重程度
Tab.3 The intensity and severity of histopathological alterations in gill and muscles tissues

注：-表示无病变，+表示轻度病变，++表示中度病变，+++表示重度病变。

3　讨论

本研究旨在探究镉对褐鳟鱼的毒性效应和利用腐植酸防止毒性的可能性。病理学研究将金属毒性归咎于自由基和活性氧。有报道发现，在暴露在含镉环境下，自由基的生成量和抗氧化防御系统都会有变化。一些研究显示，在水生生态系统环境下存在污染物，包括镉，会使细胞内形成大量活性氧，会对生物系统造成氧化性伤害。在这个意义上，镉会和一些基础金属竞争蛋白结合位点，引发Fe2+和Cu2+离子释放，从而导致活性氧生成的增加。

因此，抗氧化酶水平是研究重金属类的污染物影响的重要指标。抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶预防氧化应激反应。我们的研究中，镉处理组中褐鳟的肌肉和鱼鳃组织中的酶活(GPx and SOD)显著下降(P＜0.05)。该结果表明GPx和SOD抑制肌肉和鱼鳃组织中氧自由基形成。相似研究结果显示，重金属毒性造成组织自由基和氧化伤害，鱼受到重金属毒害时会导致SOD和GSH-Px水平降低。也有报道称镉是通过破坏线粒体酶造成细胞和组织的缺陷。

一般而言，金属引起的氧化胁迫可直接通过氧化还原反应循环引起，也可间接通过与酶促或非酶抗氧化胁迫抵御系统互作产生。因此，我们评估了MDA功效。MDA是一种膜脂过氧化的产物，它可以作为检测金属污染条件下，氧化胁迫造成细胞伤害初期的生物学指标。试验结果表明，仅施镉及镉+腐植酸组中肌肉和鳃组织中MDA水平没有变化。同时含镉环境下施加腐植酸，并没有造成肌肉和鳃组织中GPx和SOD的显著升高(P＞0.05)。

有报道称腐植酸增加了镉造成的急性和慢性毒性，腐植酸也不影响任何金属的生物富集作用。但也有研究表明腐植酸持续降低了镉在各组织器官中的富集，通过水的传播，镉可以在水生动物的全身，肌肉和脊椎中明显富集。在这个研究里，试验记录的肌肉组织中的镉含量已经高到令人担忧的水平。病理学的变化在镉+腐植酸组相对较小(图2b)，这一结果表明，腐植酸可能降低了肌肉组织中的镉中毒。

重金属伤害是很多病理性和毒害性过程中的重要因素。对鱼类，镉会造成各组织大量结构和病理性变化。鳃是一重要组织，因为其与水直接接触，任何有直接或间接影响的物质都先通过鳃才能进入鱼体内。有报道称薄层上皮黏膜对水中溶解的铅反应，造成组织渗透调节不平衡。也有试验研究显示，鳃作为镉的储藏库。

Wong等报道称，镉处理会造成罗非鱼(Oreochromis mossambicus)形态和生化反应的变化。鱼在有毒物环境下极度活跃可能是由于其鳃因刺激而受到损害引发缺氧造成的。而血红蛋白的增加可以补偿受损的呼吸效率，这在降低欧鲢(Leuciscus cephalus)镉中毒试验中有相似报道。本研究的试验结果与之相类似。因此，我们可以说这一病理学的变化是由镉毒害造成的。

总之，病理学变化的加剧和抗氧化物活性的降低说明镉处理对鳃和肌肉组织造成了伤害。腐植酸对镉造成的伤害并没有很多影响，但是发现它可以减低镉引起的肌肉组织病理学变化。因此，由于其对病理学变化降低这一作用，镉可能能够中和镉中毒。

致谢和参考文献(略)

译自：Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences，2013，13：315～320。

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