扫描微量热法研究稀腐植酸水溶液

A.N.Danilenko1, E.E.Braudo1, N.E.Pavlovskaya2, E.I.Yushkova3, and I.L.Zhuravleva1　著尹　晗迪4　译

(1　俄罗斯科学院伊曼纽尔生化物理研究院 莫斯科　俄罗斯　119991　2　奥廖尔州农业大学　奥廖尔　俄罗斯　302019　3　奥廖尔州立大学药检所　奥廖尔　俄罗斯　302028　4　兰州大学化学系　兰州　730000)

摘　要：用反相柱色谱检测发现，经过不同时间的动物扰动堆肥堆制所获得的腐植酸是由亲水组分和疏水组分组成的，其中疏水组分大体上含有较低的带电基团，这些带电基团很可能是羧酸。在差示扫描量热法测定腐植酸的稀溶液做出的热容-温度图中发现了在约58 ℃时有一个转折，这表明疏水基团水合作用的增加。我们还发现了在86-90 ℃的温度区间内有一个热容的突增，这可能是由于“胶束”内部的疏水基团的水合作用，因为类似胶束结构的疏水核有“脱玻作用”。这表明了随着堆肥时间的增加，腐植酸疏水组分的相对含量和热转变的协同性也增加，它以热容突增的形式表现出来，这很可能是因为“胶束”大小的增加。

关键词：腐植酸　疏水性　高效液相色谱　扫描微量热法　热容

A Study of Dilute Aqueous Solutions of Humic Acids by Scanning Microcalorimetry

A.N.Danilenko1, E.E.Braudo1, N.E.Pavlovskaya2, E.I.Yushkova3, and I.L.Zhuravleva1 write Handi Yin4 translate

(1 Emanuel Institute of Biochemical Physics, Russian Academy of Sciences, Moscow, Russia, 119991 2 Orel State Agricultural University, Orel, Russia, 302019 3 Medical Institute, Orel State University, Orel, Russia, 302028 4 Department of Chemistry, Lanzhou University, Lanzhou, 730000)

Abstract: It has been found by reversed_phase chromatography that humic acids obtained from vermicomposts of different duration of vermicomposting consist of a hydrophilic and a hydrophobic fractions, the hydrophobic fraction having a substantially lower content of charged, probably carboxylic, groups.A change in the sign of the temperature dependence of the heat capacity of dilute aqueous solutions of humic acids at ～58°C has been found by differential scanning microcalorimetry, which indicates an increase in the hydration of hydrophobic groups.A jump_wise increase in heat capacity in the temperature range from 86 to 90 °C was also found, which is perhaps due to hydration of hydrophobic groups in the interior of “micelles”, because of “devitrification” of the hydrophobic nucleus of micelle_like structures.It was shown that increasing the duration of vermicomposting leads to an increase in the relative content of the hydrophobic fraction of humic acids and in the cooperativity of the thermodynamic transition, which manifests itself as the jump of heat capacity, which probably results from the increase in the “micelle” size.

Key words: humic acids; hydrophobicity; high_performance liquid chromatography; scanning microcalorimetry; heat capacity

腐殖质是在有机碳死亡的转化过程中形成的，存在于土壤、泥炭、煤、水库等地。它可以区分为以下几组：(1) 腐植酸(HuA)，只能溶于碱性溶剂中；(2) 吉马多美朗酸，从用乙醇萃取腐植酸之后的潮湿残余物(胶状)中提取出来的；(3) 叶酸，可溶于水、碱或酸性溶液。有机残余物转化为腐殖质的过程被称为腐殖化过程。这个过程是凭借生物体的参与和纯粹的氧化、还原、水解、缩合等化学反应而实现的。腐殖质是在生物体外具有最稳定形态的碳有机化合物，它们的分子量组成从30 kDa到50 kDa，而叶酸则小于6 kDa。这两种物质在化学组成和分子质量上是不均匀的。腐殖质的主体是由酚类残基构成的，而外围部分则由糖类和氨基酸残基构成。

直到现在，腐殖质的准确化学结构还未确定，仅仅有一些假设模型和结构片段。然而，众所周知，腐植酸在溶液中有着线圈构象，被看成是有着不含水的疏水核和相对亲水的外围的“胶束”(类胶束结构)。但还缺少了稀溶液中“胶束”的部分热力学函数的数据，特别要关注于与腐植酸的结构和物理化学性质有关的热力学参数的研究。在这个工作中，我们研究了腐植酸的热力学参数的改变和动物扰动堆肥的过程对“胶束”组成的改变。

1　试验部分

动物堆肥的样品是使用Staratel 种蠕虫的马堆肥，动物堆肥时间分为1.5、3、和6个月(分别为样品2、3、4)，用原始的马堆肥作为对照(样品1)。样品需要在瓷研钵中彻底地研磨，并用3 mm孔径的滤网过滤。在滤过的样品中，取出5 g干燥至恒重(一式三份)用以测定其湿度。为了分离腐植酸，三份样品都要称重来收集5 g干物质。腐植酸的分离和纯化是按照相关文献中描述的方法进行的。最后一步要将腐植酸小球放入可滤过小于2 kDa的分子的透析袋，在蒸馏水中透析24 h。在装有P2O5的真空干燥器中干燥腐植酸，将备好的样品装入烧杯，放入充满氮气的干燥器，储存在4℃的冰箱中。

色谱法和量热法研究所需的腐植酸溶液配制如下：称取用上述方法制得的干燥腐植酸样品各50 mg，在磁力搅拌下溶于5 mL 0.1 N的NaOH溶液。将此溶液置入可滤过小于2 kDa的分子的透析袋，在含有0.4 M NaCl，pH 7.6的0.1 M磷酸盐缓冲液中透析过夜。

色谱法研究所需的溶液可用和量热法相同的方法制备，但需要用50 mM的pH 7.6的磷酸盐缓冲溶液进行透析。所得的腐植酸溶液的浓度是由干燥至恒重时盐的余量来决定的。

腐植酸的色谱研究使用的是配备了可获取和处理色谱数据的电脑的Gilson色谱仪,使用了Macrosphere C8,300A,250×4.6 mm色谱柱。分离腐植酸使用的流动相是：洗脱液A，10 mM，pH 7.6，含有6 mM四丁基溴化铵(TBAB)以及没有TBAB的磷酸盐缓冲液；洗脱液B，100%的含有6 mM四丁基溴化铵(TBAB)以及没有TBAB的乙腈。色谱分析法用以下的方法进行：0～10 min用洗脱液A进行等度洗脱，10～30 min从100%的A到90%的B进行梯度洗脱，30～40 min用洗脱液B进行等度洗脱。洗脱液流速是1 mL/min，样品体积是100 μL(c=1.0 mg/mL)。色谱峰的检测使用了220 nm的紫外检测器。

高灵敏度热量测定使用了DASM_4A绝热扫描微量热计(莫斯科普希诺RAS生物仪器研究所)，工作单元体积为0.4672 cm3。每次实验的热容比都用焦耳伦茨效应进行校正，温度扫描范围从20 ℃到120 ℃，加热速率为2 ℃/min，腐植酸溶液浓度为6 mg/mL。

表1　腐植酸的高效液相色谱分析结果
Tab.1 Results of analysis of humic acids by high performance liquid chromatography

图1　腐植酸色谱图(动物扰动堆肥0月)

Fig.1 Chromatogram of humic acids (0 mo of vermicomposting)

注：(1) (a) 不含四丁基溴化铵的洗脱液；(2) (b) 含6 mM四丁基溴化铵的洗脱液。(3) 条件：Macrosphere C8(300A)(250×4.6)色谱柱；洗脱液流速：1 mL/min；取样容积100 μL(c=1.0 mg/mL)；在220 nm处检测。0-10 min用洗脱液A等度洗脱；10-30 min从100%的洗脱液A到90%的洗脱液B进行梯度洗脱；30-40 min用洗脱液B进行等度洗脱。洗脱液A为10 mM，pH 7.6的磷酸盐缓冲液；洗脱液B，100%的乙腈。

2　结果与讨论

在图1中，我们展示了样品4的色谱图(其他样品的色谱图类似)，分别用含离子对试剂四丁基溴化铵和不含它的洗脱液洗脱出来(分别为图1b和1a)。不含四丁基溴化铵的色谱图有两个峰：峰1对应的是部分疏水腐植酸，因为它们被水从色谱柱中洗脱出来，保留时间较低；峰2对应的是用70%的乙腈洗脱出来的疏水腐植酸。在洗脱液中加入了四丁基溴化铵后，峰1消失了，同时，峰2的面积相应的增加了。这样的现象为所有腐植酸样品的共性。得到的结果有理由认为图1a中峰1和2之间的差异主要是由腐植酸的离子化基团的含量决定的。考虑到实验是在pH 7.6的条件下进行的，这个基团最有可能是羧基。根据相关文献数据，大量的腐植酸中包含的这些基团的量为3～7 mM/ g。应该被注意到，带电基团同样出现在疏水部分的腐植酸中(图1a，峰2)，当在洗脱液中加入四丁基溴化铵后，疏水部分的洗脱时间从28 min增加到了31 min，峰也变得对称了(图1b)。

表1中我们列出了使用不含四丁基溴化铵的洗脱液洗脱时获得的所有腐植酸样品的色谱数据。可以看出，第二部分腐植酸的相对含量随着动物扰动堆肥的时间增长而增加。这个事实连同在洗脱液中加入四丁基溴化铵时获得的色谱数据证明了在动物扰动堆肥的过程中带电基团的含量有下降的趋势。

在C-D段，腐植酸的热容在很窄的区间内发生了猛增，表示这个转变的热力学参数(中转变温度，转变区间，热容突增量)不依赖于此区间的扫描速度0.5～4 ℃/min。在此基础上，我们可以认为这个转变过程程现平衡态。我们认为这个转变反映了疏水基团形成“胶束”核的水合作用是由于微胞内流动性的突增，也就是胶束的疏水核的脱玻作用。

经历了不同时间的动物扰动堆肥隔离堆制出的腐植酸转变的热力学特征列于表2。可以看出,动物扰动堆肥的过程不影响热容突增量，然而转变温度随着堆肥时间的增长而增加，过度带宽则随着堆肥时间的增长而减小。后者意味着堆肥的过程中存在着过渡协同效应程度的增长，这明确地证明了“胶束”质量的增加。

如前所述，“胶束”的热越迁可能与“胶束”疏水核的脱玻效应还有疏水基团的水合作用有关。的却，众所周知，腐殖质(腐植酸和叶酸)的脱玻效应的热容突增不超过0.03 J/(g·K)。因此，我们所观测到的热容突增[0.6 J/(g·K)]几乎全部是由于脱玻的“胶束”核的疏水基团的水和作用产生的。

图2　不同动物扰动堆肥时间的腐植酸溶液的热分析图

Fig.2 Thermograms of solutions of humic acids from vermicomposts of different time of vermicomposting (1 – 0 mo; 2 – 3 mo; 3 – 6 mo)

注：腐植酸浓度为6 mg/mL，溶于pH 7.6，含0.4 M NaCl的0.1 M磷酸盐缓冲液中；Δttr为转变温度，Δttr为转变区间；ΔCp为突增热容。区间：A-B—热容增加，B-C—热容下降，C-D—热容突增。

图3a,b为热转变区间的温度和宽度对疏水组分在样品中的含量所作的图。可以看出热转变温度大致以指数形式随着腐植酸疏水性的增加而增加。同时，转变温度区间的宽度(协同性的程度)随着样品疏水性的增加而减小。因此，随着堆肥时间的增加，腐植酸疏水性增加，还伴随着热容突增的协同性的增长，这明显是由于“胶束”质量(更确切的说是动力学单元的平均数)的增加。

图3　温度(a)温度区间宽度(b)在不同动物扰动堆肥时间堆制所得的腐植酸的“胶束”热跃迁，对疏水组分组成的相对含量(F2,%)作图

Fig.3 Dependences of temperature (a) and width of temperature interval (b) of thermal transition in “micelles” of humic acids in vermicomposts of different time of vermicomposting on the relative content in their composition of the hydrophobic fraction (F2, %)

表2　腐植酸稀溶液的热容突增参数
Tab.2 Parameters of the jump in heat capacity of humic acids in dilute solution

3　结论

在不同时间动物扰动堆肥隔离堆制的腐植酸的稀溶液中，在86～90 ℃的温度区间，发现了一个热容的突增，明显是以“胶束”核的疏水基团的水合作用为前提条件的。

动物扰动堆肥时间的增加导致腐植酸非极性组分含量的升高，其特点是电荷含量相对较低。除此之外，动物扰动堆肥时间的增加使热容突增的温度升高，其协同性也增加。

参考文献(略)

译自：A.N.Danilenko, E.E.Braudo, N.E.Pavlovskaya, E.I.Yushkova, I.L.Zhuravleva, 2011, published in Biofizika, 2011, 56, (1): 57～61。