腐植酸生物农药的研制途径及应用进展

腐植酸生物农药的研制途径及应用进展_2014年论文集

腐植酸生物农药的研制途径及应用进展

周霞萍

（华东理工大学　上海　200237）

摘　要：腐植酸主要是植物残体在微生物作用下分解和合成的一类天然有机大分子，具有一定的抗菌、抗病、杀虫作用，在腐植酸叶面肥、冲施肥、基肥使用中有“药肥”的美称。但是因为“药肥”尚不符合生物农药的国家标准，腐植酸还不能定为生物农药。本文探讨介绍了腐植酸可以制成某些标准化生物农药的途径及应用新进展。

关键词：腐植酸　生物农药　研制途径　应用进展

Development Approach and Application Progress of Humic Acid Biological Pesticide

Zhou Xiaping

(East China University of Science and Technology, Shanghai, 200237)

Abstract: Humic acid is a class of natural organic macromolecules obtained from the decomposition and synthesis of plant residues by microorganisms.Due to its antibacterial, antiviral and insecticidal effectivenss, the humic acid is given the name of “medicine fertilizer” for its use in humic acid foliar fertilizer, fertilizer, fertilizer.However humic acid can not be classified as biological pesticide because it has not yet met the national standard of biological pesticide.This article discussed the development approaches and application progress of making humic acid as a standardized biological pesticide.

Key words: humic acid; biological pesticides; development approach; application development

腐植酸是动植物(主要是植物)残体在微生物作用下分解和合成的一类天然有机大分子，其复杂多样的结构组合、官能团，使它具有一定的抗菌、抗病、杀虫作用和某些生物活性。腐植酸在叶面肥、冲施肥、基肥使用中有“药肥”的美称，但是尚不能定为生物农药。因为国家农药局传统的农药、肥料冠名中，没有“药肥”的系列标准。“药肥”也尚不符合生物农药的相关国家标准。

通常“生物农药”是指利用生物活体(真菌、细菌、昆虫病毒等)或其代谢产物(信息素、生长素、萘乙酸、2，4-D等)针对农业有害生物进行杀灭或抑制的制剂。生物农药包括真菌农药、植物农药、病毒农药、细菌农药、抗生素农药、动物农药等类别。

本文根据文献调研、国内外同行及作者的研究成果，探讨介绍了腐植酸可以制成某些标准化生物农药的途径及应用新进展。

1　腐植酸研制抗菌抗病杀虫的微生物农药途径及应用进展

腐植酸微生物农药以微生物菌肥的形式，在行业内已试行多年。微生物是杂食性的，一般生物能利用的，微生物能利用；一般生物不能利用的，微生物也能利用；一般生物有害的，微生物还能利用。因此，无论在其发酵过程(可理解为微生物的自身繁殖过程)，还是在土壤内的生命活动过程中，腐植酸微生物农药(微生物菌肥)若在植物根系生长、繁殖，形成优势菌群，可抑制和减少病原的入侵和繁殖机会，起到减轻作物病害的功效；还可以不断释放出植物生长所需要的营养元素，包括赤霉素和细胞激素类作物生长素，达到保肥、减少盐胁迫对植物危害，改善土壤环境，使作物增产等作用。

中国农业大学袁红莉推荐的防治土媒病原菌和防治叶面病害的有枯草杆菌(Bacillus subtilis)，放线农杆菌(Agrobacterium rubiobacter)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，产气肠杆菌(Burkhoderia cepacia)，浅灰绿链霉菌(Streptomyces griscoviridis)，绿色木莓、丛枝菌根(Arbuscular mycorrhiza, AM)。推荐的防治蔬果收获后被病害的微生物杀菌剂为：丁香假单孢菌(Pseudomonoas syringae)，亲油假丝酵母菌(Canadidaoleophila)。推荐的微生物杀虫剂以两类真菌为主，第一类为线虫捕捉真菌的Arthrobotrys、Dactylella、Monacrosporium及Nematoctonus等属，通过设构造杀虫害；第二类为线虫体内寄生真菌(Harposporium及Drechmeria conispora)。当真菌孢子被线虫取食后，在线虫体内肠道发芽繁殖，使线虫致死。同时推荐的解磷菌——霉菌(Aspergillus)、根霉(Rhizopus)、镰刀菌(Fusarium)、小菌核菌(Sclerotium)、AM菌根菌；解钾菌——胶冻样芽孢杆菌、硅酸盐细菌、浸麻芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌，以及EM菌剂等[1]，与腐植酸、土壤腐殖质一起发挥着多种功能，但也可能因为各菌种作用机理不同、不恰当选择等，出现相互抵消、效果不显著等现象。

培育单一菌种(图1)将腐植酸作为固定化酶载体，构成有靶向性的微生物农药是一种趋势。因依据主力菌效应(密集效应)，微生物竞争生存效应，可针对性地拮抗土传病菌，减少重茬微生物的负面影响[2，3]。

图1　华东理工大学培育的单种菌图示

Fig.1 Single species bacteria bred by ECUST

木霉菌生物农药系新型生物杀菌剂。它通过产生抗生素、营养竞争、微寄生、细胞壁分解酵素、以及诱导植物产生抗性等机制，对多种植物病原菌都具有拮抗作用，具有保护和治疗双重功效，可有效防治土传性真菌病害，在苗床使用木霉菌剂，可提高育苗与移植的成活率，保持秧苗健壮生长。也可用于防治灰霉病。

上海通微生物有限公司在上海交通大学的木霉菌杀菌剂研制的基础上，制成了木霉腐植酸(简称TBHA)产品，它通过试验筛选木霉菌(Trichoderma)或萤光假单孢菌复合剂，由专门配制的木霉腐植酸培养基发酵产生木霉菌体和分生孢子等加工制成产品。

据检测该“木霉腐植酸”产品，含大量酶、激素、生物酸、活性分子和抗生素等；其中的激素类物质对作物生长有促进作用，一般可•产10%～15%；生物酸具有解磷、解钾作用，可提高化肥利用率30%以上；其他活性物质可降解敌敌畏90%，降解辛硫磷30%～50%，降解氰化物80%，吸附重金属Cd、Cu 40%～60%；若继而采用“功能基因转化”“生物矿化”“生物吸附”等系统生防工程，对土•污染修复，将有明显作用和效果[4，5]。这是一个典型的腐植酸新产品示例，在尚没有“药肥”标准的前提下，其产品是申请微生物肥料还是申请微生物农药？倘若要申请木霉腐植酸生物杀菌剂，应该首先说明木霉腐植酸的抗菌(杀菌)效果比较原木霉菌的情况，其次才解释其附加的作用。

西葫芦是一种世界范围的常食用蔬菜，镰刀菌会引起西葫芦的枯萎病，而丛枝菌根真菌是最普遍的根部共生真菌，土耳其的S.Sensoy等[6]分别进行了丛枝菌根真菌、尖孢镰刀菌与腐植酸、乳清的单一试验和不同的组合试验，得出腐植酸可以促进植物养分的吸收、植物生长和抵抗非生物逆境。腐植酸在含盐条件下会增加丛枝菌根真菌(AMF)的作用，与乳清等促进西葫芦幼苗增长并抑制枯萎病，得到了显著性P<0.05的结果。该示例显现，腐植酸与丛枝菌根真菌(AMF)组合，可以抗菌(镰刀菌)、抗病(枯萎病)。按此例拓展，可以研发成抗菌类腐植酸-微生物农药，也可以研发成抗病类-腐植酸植物农药。

2　腐植酸研制抗病类动植物农药的途径及应用进展

研制腐植酸抗病类动植物农药有多种途径，除了上述的与微生物菌种发挥协同效应以外，利用黄腐酸、腐植酸的胶体性质，增加农药溶解性、提高药效、减少用量和次数是业内展开较好的。以专家推荐的代森锰锌为例，它是一种广谱的保护性杀菌剂，属于低毒农药，其剂型为可湿性粉剂，有效含量≥80%，可防治梨黑星病、苹果斑点落叶病、瓜菜类疫病、霜霉病、大田作物锈病等各类真菌性病害。

腐植酸与“代森锰锌”要形成可溶性的生物农药，应依据 •COOH、-OH的数量才能配位，才能提高农药的稳定性，如构成下图(图2)的腐植酸(氧化态的木质素或磺化态木质素)生物农药结构[7]，为缺锌症状的植物增强抵抗病害的能力，发挥杀菌作用。

图2　代森锰锌与腐植酸(氧化态的木质素或磺化态木质素)的组合结构

Fig.2 Composite structure of mancozeb and humic acid (lignin under oxidation or sulfonated state)

此外，研制腐植酸抗病类动植物农药还有不同的途径。

(1)腐植酸盐类抗病害。它依据结构官能团特点，通过微量元素与羧基、酚羟基的置换、螯合(络合)制成。如，在辽宁苹果树发生缺铁性黄化病时，王宝申等[8]用腐植酸铁在叶面喷施病树，改变了果树失绿、色淡、红色素不能生长病灶，提高了苹果Vc含量、糖分含量及产量。日本Jun Y.Kima等[9]在研究纳米银对日本青鳉胚胎的影响时发现，腐植酸与银离子的络合(形成腐植酸银盐)作用、凝聚效应可减少“纳米银”对青鳉胚胎的生物利用度，降低“纳米银”对青鳉胚胎的毒性。土耳其Gonca Alak[10]研究腐植酸对褐鳟鱼鳃和肌肉中镉毒性的组织病理和生化指标影响时，将褐鳟暴露于2 ppm镉和5 ppm腐植酸中，发现褐鳟鱼鳃和肌肉组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的浓度明显低于对照组(P＜0.05)，减少了镉引起鳟鱼肌肉和鳃组织的毒性。

(2)腐植酸抗病害。利用泥炭、年青褐煤、生化腐植酸原料中含有的植物内源激素，如甾醇、萜类、维生素(如VB2、VB6、VB12 V8)、叶酸、肉桂酸、香豆酸、苯氨基酸、氨基嘌呤等，可研发出腐植酸-维生素复合型抗病类植物农药，腐植酸-氨基酸复合型抗病类植物农药，以及腐植酸-核苷酸复合型抗病类植物农药。

由于维生素、氨基酸的功能是已知的，选择性地与腐植酸复合可增加抗病害生物农药的靶向性。如腐植酸中的酚羟基可与氨基酸的氨基、羧基结合，腐植酸中芳烃的疏水结构可阻止细菌的侵染，使其具有抑菌性。

核酸属于生物大分子，核苷酸通常认为是小于50 bp的核酸片段，包括反义寡核苷酸、CpC寡核苷酸、Aptamer、Decoy、核酶、siRNA、microRNA等。它具有抑制某些病害基因的功能，有些内源性寡核苷酸(如microRNA)还具有疾病诊断和预后评估的价值。除医药应用外，核苷酸也是组成腐植酸-生物农药的重要单元。

(3)腐植酸-多糖结构抗病害。业内皆知，植物秸秆生物质主要由纤维素(~葡聚糖)、半纤维(~木聚糖)、木质素(~腐植酸)组成，通过生物发酵降解等技术可以制成葡聚糖、木聚糖、腐植酸等，由于它们源于同一个生命体组织，常常难解难分。而多糖(聚糖)也是国内腐植酸质量标准中要求分离剔除的。近年，美国、西班牙、法国的Vaclav Vetvicka等[11]选择作为免疫调节剂已超过50年的β1,3-葡聚糖，利用它的成熟性，研究葡聚糖与腐植酸提高免疫力的协同作用。该实验购自的葡聚糖有可溶性葡聚糖和不溶性葡聚糖两种，其中可溶性葡聚糖源自海带多糖，不溶性葡聚糖源自酵母。试验所用的腐植酸，一个提取自捷克共和国(HZ)的风化褐煤，另一个提取自中国(HC)的褐煤。Vaclav Vetvicka等[12]对不同的腐植酸进行分离，并根据国际腐殖质协会的程序进行纯化，并冷冻干燥。同时用固态13C-核磁共振(NMR)光谱，元素分析比较HZ与HC结构官能团等。虽然，捷克风化煤(HZ)与中国褐煤(HC)的元素及NMR分析结果有区别(表1、表2)。

研究结果显示，这两种腐植酸都具有生物免疫调节活性，可影响体液和细胞的免疫反应。且HZ和HC在免疫反应中都有协同作用。不过，类似的抗体应答发现HZ在9∶1时表现出最高的数值，而HC，在1∶1和1∶9时均表现出最高的数值。Vaclav Vetvicka等[13]指出，在他们之前DitteovaG等[14]研究过Vc与β1,3-葡聚糖的作用。该例从某种意义上说，支持了本文中“腐植酸抗病害”介绍的研制生物农药的途径。从该例等衍生的免疫食品用生物农药品种正在华东理工大学、上海臻衍生物科技公司试产。

表1　腐植酸样品的元素分析

注：a采用差减法测定。

表2　HA样品的13C-核磁共振(NMR)光谱分析

(4)腐植酸次生代谢物抗病害。赤霉素、吲哚乙酸和丁酸、α-萘乙酸、脱落酸、细胞分裂素、乙烯利是业内熟悉的生长素或激素，它可能通过人为施入土壤的农药的分解转化残留构成，也包括腐植酸在微生物菌的作用下，产生次生代谢物。腐植酸类生长素根据土壤环境特征，调控着不同生长期作物的生物活性，可形成良性循环的生物农药抗病效果。

研制生产腐植酸生长素类农药，可以从风化煤、褐煤、泥炭等天然腐植酸原料提取、组合，也可以选择秸秆类生物质原料，采用生物发酵方式制取。

腐植酸原料中含有的水溶性倍半萜、双萜、三萜类，通过微生物细胞膜，干扰了能量代谢的酶促反应，影响其能量代谢途径来达到抗菌抗病害效果。

腐植酸次生代谢物在抗病虫害的前提下，对蔬果品质的提高是否有影响？能否等同或优于有机果品？这是腐植酸生物素农药是否拥有市场前景的关键。

3　腐植酸研制杀虫类生物农药的途径及应用进展

杀虫类生物农药有按病毒分类的，有按昆虫的病原病毒分类的，也有系列DNA病毒杀虫剂(NPV、GV、EPV、DNA)、RNA病毒杀虫剂(CPA、其他RNA)等；而植物类杀虫剂则按功能分类，如毒素类植物杀虫剂、拒食类植物杀虫剂、绝育类植物杀虫剂等；菌类杀虫剂中应用广泛的有“苏云金芽孢杆菌杀虫剂”等。

腐植酸类生物农药杀虫剂，不仅可利用腐植酸的吸附性能，毒化、菌丝特化所产生的粘着网、粘着球、收缩环或非收缩环等主要捕捉线虫的机理，以及真菌寄生于线虫体内，被线虫食后，在线虫体内肠道发芽繁殖，使线虫致死的途径；还可以利用腐植酸中脂溶性甾类，容易穿透病虫细胞膜进入病虫细胞体内，干扰细胞膜的通透性，引起病虫细胞凋亡(apoptosis)。

腐植酸植物类杀虫剂，可富选番茄碱、胡椒籽、大蒜素、烟碱、除虫菊素等构成生化腐植酸原料，通过生物技术研发虫害毒素类杀虫剂，拒食类植物杀虫剂等。

结合中草药应用的悠久历史和稳定性能，在腐植酸结构组成与作用机理的支撑下，建立成熟的中草药-腐植酸生物杀虫剂生产线，是有远景效益的。这方面，国家863项目“生物源农药创制与技术集成及产业化开发”，已经选泽雷公藤等中草药在进行试验。为首的单位有中国农业大学、上海交通大学农学院、华南农业大学、华东理工大学药学院农药室等。

4　展望

以上探讨了研制开发腐植酸生物农药可能的途径。作为腐植酸系列生物农药，在成为商品药前，要确定原料药生产工艺[14，15]、原料药结构与质量标准、辅料来源与质量标准，包装材料及容器、稳定性试验，并需要有生测实验报告，要有生物农药的残毒、残留及安全性的数据。包括急性毒性试验，LD50、致敏性、30天致病性试验(常规项目)，以及农药安全性评价、环境安全(水、土、大气)评价等试验以后，才能进行腐植酸-生物农药登记注册。

腐植酸在化学农药中应用，在行业内开展已久，从理论到实践有不少成果；腐植酸在生物农药中的应用，以叶面肥、喷施肥、植物生长营养液(生长素)等形式也悄然开展；腐植酸与生物农药结合，既有药效且有肥效的性质，但是在国家尚没有建立“药肥”标准的情况下，研制开发系列腐植酸-生物农药，有恰当的方式评价腐植酸生物农药质量，推广应用腐植酸环保型生物农药，对提升我国生物农药国际国内的竞争力十分必要。

参考文献

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