秸秆发酵制备生物腐植酸钠

秸秆发酵制备生物腐植酸钠_2014年论文集

秸秆发酵制备生物腐植酸钠

辅琳瑜　安　鹏　刘　丽　何彩萍　邱浩峰　李加友

（嘉兴学院生物与化学工程学院　嘉兴　314001）

摘　要：利用高效秸秆降解菌株进行秸秆发酵，提取生物腐植酸钠，并对其提取工艺进行优化，对生物腐植酸钠的理化性质进行测定。通过对提取温度、提取时间、碱液用量以及碱液浓度等条件的控制进行生物腐植酸钠提取工艺优化，并针对提取得到的生物腐植酸钠进行pH、羧基、C.E.C等理化性质测定。试验结果表明，碱液浓度、用量、操作温度以及提取时间这4个因素都是影响腐植酸钠提取的最主要因素。在最优条件下，即在1g秸秆中加入10 mL，2%NaOH的溶液在65 ℃的温度条件下水浴2 h，可得到最大生物腐植酸钠提取率11.1%。提取时间、温度、提取液的浓度和用量对于秸秆发酵生物腐植酸钠的提取都有一定程度上的影响，增加了水稻秸秆降解提取生物腐植酸钠的产量，具有较好的应用前景。

关键词：秸秆　生物腐植酸钠　发酵　提取　理化性质检测

Preparation and Application of the Biological Humic Acid Sodium Fermentation of Straw

Fu Linyu, An Peng, Liu Li, He Caiping, Qiu Haofeng, Li Jiayou

(College of biological Chemical Science and Engineering, Jiaxing Unerversity, Jiaxing, 314001)

Abstract: The experiment aims at optimizing the extraction process of the biological humic acid sodium which is abstracted by fermenting straw through effective straw degradation strains, and measuring its physicochemical property.The optimization of the biological humic acid sodium extraction process is done by controlling conditions including temperature, duration, dosage and concentration of alkali liquor.Then we measure the physicochemical property of the extracted the biological humic acid sodium, such as PH, carboxyl and C.E.C, etc.The result shows that the above four factors, which are temperature, duration, dosage and concentration of alkali liquor are most dominant.In the water bath of 65℃, 1g straw with 10ml solution of 2% NaOH can get the maximum extraction ratio (11.1%)of the biological

humic acid sodium and that is the optimum condition.The duration, temperature, concentration and dosage of extract

ing solution all have certain impact on the extraction of the biological humic acid sodium.The experiment helps to find

ways with good application prospect to improve the production of the biological humic acid sodium.

Key words: straw; the biological humic acid sodium; fermentation; extraction; properties detection

生物腐植酸作为生物大分子在畜牧、种植、医药等行业都有举足轻重的地位以及发展前景，与天然腐植酸相比，生物腐植酸的生产方式更清洁、环保，应用范围之广、之大都成为了其未来发展的基础。

生物腐植酸是一种具有较强生理活性的营养物质[1]，在养殖业中常用作添加剂。家畜养殖中，添加到饲料中可促进猪只生长、提高饲料报酬和抗病能力[2,3]，对奶牛还有一定防病保健作用，可减少奶牛消化系统疾病发生[4,5]；在家禽养殖中，向饲料中添加一定量的生物腐植酸制剂，家禽的料肉比即显著下降[6]，提高产蛋率[7]。生物腐植酸能提高水产动物对饲料的利用率，降低发病率、死亡率[8]，节约资源，减少投入[9]，综合经济效益显著提高。

生物腐植酸用作肥料助剂，具有缩小气孔开张度，减少水分蒸腾[10]，促进根系发育，提高根系活力[11]，提高作物耐盐碱性的功能。近年来，生物腐植酸在种植业方面发挥着巨大的作用：用生物腐植酸灌根喷施，取得了显著的抗旱效果[12]，利用生物腐植酸处理苜蓿种子2 h，可显著增强种子的抗旱性[13]；并且生物腐植酸中也含有一定量的微量元素以及一些小分子氨基酸物质，促进植物生长，容易吸收，提高出苗率和成活率[14]。徐全辉等[15]研究了生物腐植酸有机肥对水稻产量和养分吸收的影响，其结果表明：腐植酸有机肥以生物腐植酸为载体，采用现代腐植酸生物工程技术，吸附高效固氮菌、磷菌、解钾菌和双效菌，并加入植物生长所需营养元素，促进作物增产。

生物腐植酸有多种生物活性组分，在医药的研究中取得了重大进展，如生物腐植酸中“醌基”氧化还原为“酚基”的周期行为[16]，萜类、蓄类(雌醇、雌酮等)天然激素的主要作用。萜类β一紫罗兰酮对正常结肠细胞CCD l8的IC 50值比其对Cac 022结肠癌细胞IC 50高3倍[17，18]。Pierluigi Mauri等[19～21]的试验得出：萜类有抗血小板聚集的作用，这一成果也适用于人体，并可衍生其用于烧伤、急性胰腺炎等疾病治疗。

本研究利用高效秸秆降解菌株进行秸秆发酵，提取生物腐植酸钠，并对其提取工艺进行优化，对生物腐植酸的理化性质进行测定，通过对提取温度、提取时间、碱液用量以及碱液浓度等条件的控制进行生物腐植酸钠提取工艺优化。

1　材料与方法

1.1　试验材料

原料：水稻秸秆，水稻秸秆经粉碎机粉碎，至能通过孔径为0.5 mm的筛板，保留存放在一个密封的塑料袋，室温保存。

试剂和溶液：0.1 mol/L NaOH标准溶液；0.1 mol/L盐酸标准溶液；0.1 mol/L BaCl2溶液；0.25 mol/L醋酸钙溶液；95%乙醇，化学纯；0.05 mol/L NaHCO3溶液；0.1 mol/L CaCl2溶液。

1.2　主要仪器和设备

主要仪器和设备如表1所列。

表1　主要仪器和设备

1.3　试验流程

本项目的试验流程图见图1。

1.4　试验方法

1.4.1　秸秆发酵

称取200 g水稻秸秆于发酵桶中，加60 mL助腐剂、540 mL水和0.2 g NH4NO3，充分搅拌，分装35罐，接种秸秆高效降解菌，于28 ℃恒温箱中发酵培养，使菌种充分与秸秆接触，降解秸秆。培养28天后，对发酵已达到成熟的秸秆进行生物腐植酸钠的提取，按照容量法测定生物腐植酸钠的含量。

图1　试验流程图

Fig.1 The flow chart of the experiment

1.4.2　生物腐植酸钠提取工艺优化

利用生物腐植酸的碱溶性对含有腐植酸的秸秆进行水浴碱提，使腐植酸溶于碱液中，然后进行提取分离。

1.4.3　腐植酸含氧功能团的分析

含氧功能团是生物腐植酸最具特征性的基团。它们主要指总酸性基、羧基、酚羟基、醇羟基、 羰基、甲氧基、醌基等。羧基、酚羟基是腐植酸呈酸性的主要基团，羟基醌，烯醇基也有这样的作用。正是由于这些基团，生物腐植酸才具有阳离子交换能力，可以和铵盐、碱金属盐、磷酸盐、土壤中的矿物质，重金属盐、微量元素、稀有元素等形成各种可溶或不溶性的盐以及稳定程度不同的有机-无机复合物。

(1)总酸性基的测定采用碱溶氯化钡沉淀电位滴定法[22]：

式中，V2—空白滴定用酸体积，mL；V1—样品滴定用酸体积，mL；MHCl—盐酸标准液浓度，mol/L；W—样重，g。

(2)羧基的测定采用碱溶酸析醋酸钙法(常量法)[22]：

式中，M—标准NaOH溶液浓度，mol/L；V1—滴定试样消耗的NaOH体积，mL；V2—滴定空白消耗的NaOH体积，mL；V0—试液总体积，mL；V—滴定时分取试液的体积，mL；G—试样重，g。

1.4.4　生物腐植酸钠理化性质的分析

(1)pH值的测定[22]：使用酸度计测定。

(2)交换容量(C.E.C.)的测定采用盐酸回滴法[22]：

式中，M1—NaOH溶液浓度，mol/L；V1—加入NaOH溶液的体积，mL；M2—HCl标准溶液浓度，mol/L；V2—滴定消耗HCl的体积，mL；G—试样重，g。

(3)E4/E6的测定[22]：用分光光度计分别测定465 nm和665 nm光密度，用0.05 mol/L NaHCO3作参比液，取三次测定的平均值为测定结果。

式中，E465—在波长465nm处的光密度；E665—在波长665 nm出的光密度。

(4)凝聚限度的测定[22]：

式中，M—CaCl2浓度，此处为0.1 mol/L；V—达到凝聚限度时的最少CaCl2加量，mL。

2　结果与讨论

2.2　生物腐植酸钠提取优化测定结果

2.2.1　标准曲线的测定

试验所得数据见表2，并根据其结果绘制出标准曲线(图2)。

经测定，生物腐植酸钠的产率最高可达50%，平均含量为48%，远高于从煤中提取的腐植酸含量。说明利用此种微生物发酵方法制备生物腐植酸钠效益更好，更能满足生活生产用量。由图2可以看出，腐植酸浓度与吸光度(A)复相关系数R2为0.9926，直线回归方程为：y(g/mL)＝1.2832x－0.2644。

表2　不同浓度生物腐植酸的吸光度

图2　生物腐植酸标准曲线

Fig.2 Humic acid standard curve

2.2.2　生物腐植酸钠的工艺优化

(1)NaOH浓度。

由表3可知，当NaOH溶液的浓度小于20‰时，生物腐植酸钠的提取率随NaOH的浓度增大而提高，且当NaOH溶液浓度为20‰ 时对生物腐植酸钠的提取率达最高，当NaOH浓度高过20‰后，生物腐植酸钠的提取率又开始下降。由此为碱液浸提过程提供了数据依据。

表3　不同浓度NaOH对生物腐植酸钠提取率的影响

(2)NaOH用量。

由表4可知，在以上试验中，当NaOH的用量为0.078g时，样品吸光度值最大，此时生物腐植酸钠的提取率达到最高。说明NaOH的用量对生物腐植酸钠的提取率影响很大。

表4　不同用量的NaOH对生物腐植酸钠提取率的影响

(3)提取温度。

由表5可知，在以上试验中，当操作温度为65℃时，样品吸光度值较高，生物腐植酸钠的提取率达最高，在此温度基准上调或者下降温度都会降低生物腐植酸钠的提取率。

表5　操作温度对生物腐植酸钠提取率的影响

(4)提取时间。

由表6可知，在以上试验中，当提取时间为2h，样品吸光度值最大，生物腐植酸钠的提取率最高。由此可知，在提取过程中，对提取时间的控制也很重要。

表6　提取时间对生物腐植酸钠提取率的影响

2.3 生物腐植酸总酸性基测定结果

试验所得数据：V2=8.5-0.6=7.9.4mL， V1=13.7-8.0=56.7mL，MHCl=0.1mol/L，W=0.0505g。因此，

以上数据说明，生物腐植酸钠有一定数量的酸性基团，利于和铵盐，碱金属盐和土壤中的矿物质形成不溶性的盐以及稳定程度不同的复合物，为生物腐植酸做肥料提供了理论依据。

2.4　生物腐植酸钠羧基测定结果

试验所得数据：M=0.01mol/L，V1=5.8-2.7=3.1mL，Vc=11.9-10.2=1.7mL，V0=25mL，G=0.0453g。因此，以上数据说明，生物腐植酸钠的有一定含量的羧基。因此，生物腐植酸具有一定的阳离子交换能力，为生物腐植酸作有机肥料，提高土壤肥力，作动物饲料，使动物增殖增产提供了理论依据。

2.5　生物腐植酸钠pH值测定结果

试验所得数据：pH=10.57，说明腐植酸盐是一种碱性物质，进而说明腐植酸是一种弱酸。

2.6　生物腐植酸钠交换容量(C.E.C.)测定结果

所得数据：M1=0.1 mol/L，V1=25 mL，M2= 0.1 mol/L，V2=18.6 mL，G=0.5001 g。因此，

可以看出，生物腐植酸钠的交换容量较小。

2.7　生物腐植酸钠E4/E6测定结果

E465和E665的测定结果见表7。可以看出，E465=0.175，E665=0.02，E4/E6=8.735，说明腐生物植酸钠的芳香缩合度较低，分子量较大，基团较多。

表7　E465和E665的测定结果

2.8　生物腐植酸钠凝聚限度测定结果

试验所得数据：V=0.32 mL。因此，凝聚限度=200×0.1×0.00032=0.0064 mmol/L，说明生物腐植酸钠具有一定的凝聚能力，耐盐和抗电解质絮凝能力，为生物腐植酸钠作絮凝剂应用提供了理论依据。

3　结论

该项研究对秸秆发酵腐植酸钠提取条件的单因素优化试验中，得到的最优结果如下：在1g秸秆中加入10 mL，20‰NaOH的溶液在65 ℃的温度条件下水浴2 h，相对于其他因素变化，可得到最大生物腐植酸钠提取率。在最优条件下，生物腐植酸钠提取率可达到11.1%。这些结果表明，提取生物腐植酸钠的温度、时间以及碱液的用量都影响着生物腐植酸钠提取率的变化。而对试验制品生物腐植酸钠的检测结果表明，生物腐植酸钠是一种碱性物质，其羧基含量较低，交换容量较小，并具有一定凝聚性。故秸秆发酵生产生物腐植酸钠作为一种新的生产方式不仅仅解决了秸秆资源利用化的问题，也解决了从有限资源煤炭中提取腐植酸的弊端。随着研究地深入，腐植酸类物质必然有更加广阔的应用前景。

参考文献

[1]陆新浩，刘鸿，朱梦代，等.畜禽饲料中添加益生酸的试验及应用简报[J].上海畜牧兽医通讯，2003，(1)：39

[2]乌兰，罗旭光，仝宝生，等.黄腐酸对仔猪生长性能与抗病力的影响[J].现代农业科技，2009，9：238～239

[3]王东卫，杨前锋.腐植酸发酵物对肉牛增重的试验观察[J].河南农业科学，2008，(6)：123～124

[4]韩瑞华，左建武，刘全才，等.腐植酸钠对荷斯坦牛泌乳性能的影响[J].中国牧业通讯，2008，21：43～45

[5]谷子林，任文社，黄仁录，等.生化黄腐酸在奶牛生产中的应用研究[J].中国奶牛，2001，(5)：23～25

[6]杨前锋，王东卫，葛慎锋.腐植酸发酵物对肉鸡增重的影响[J].畜牧与兽医，2008，40(9)：43～44

[7]蒋安文，刘维华.腐植酸盐和四环素渣饲喂蛋鸡试验[J].2000，22(7)：20～21

[8]朱银安，王庆，单红.腐植酸钠添加剂在青虾饲料应用中的促进生长效果试验[J].水产养殖，2009，30(10)：63～64

[9]孙卫明.盐碱地池塘中浮游生物的控制与调节技术研究[D].中国海洋大学，2006

[10]许旭旦.在非干旱情况下叶面喷施黄腐酸的增产效果的研究[J].腐植酸，1984，(4)：18～22，36

[11]诸涵素，王在卿.黄腐酸拌种对小麦增产作用的研究[J].河南农业科学，1987，(9)：7～9

[12]杨晓玲，朱京涛，张建文.生化黄腐酸的提取及其理化性质的研究[J].吉林农业大学学报，2003，25(1)：18～20

[13]田新会.黄腐酸对不同苜蓿品种抗早性的影响[J].草业科学，2004，(9)：20～23

[14]Ayuso M, H.ZT, and G.C, A Comparatives study of the effect on Barley growth of humic substances extracted  from municipal wastes and from traditional organic materials[J].Journal of Science food agriculture, 1996, 72(4): 493～500

[15]徐全辉，高仰，赵强，等．活性腐植酸生物有机肥对水稻产量和养分吸收的影响[J].安徽农业科学，2010，38(8)：3951～3952

[16]武丽萍，成绍鑫，吴奇虎，等.褐煤硝酸降解性能及其产物的结构解析[J].燃料化学学报，1990，18(8)：199～206

[17]占爱瑶，由香玲，詹亚光.植物萜类化合物的生物合成及应用[J].生物技术通讯，2010，(1):131～135

[18]韩淑燕，潘扬，丁岗，等.1H-NMR和13C-NMR在山茱萸环烯醚萜类化合物结构鉴定中的应用[J].中华中医药学刊，2004，(1)：56～59

[19]Cyndua A.Jolt, Michael J.Alessandrino, Anna Heitz..Disinfection by-products from halogenation of aqueous solution of terpenoids.waterresearch, 2010, (44): 232～242

[20]Pierluigi Mauri, Antonella D e Palma, Francesca Pozzi, Fabrizio Basilico, Antonella Riva, Paolo Morazzoni, Ezio Bombardelli, Giuseppe Rossoni.LC-MS characterization of terpene lactones in plasma of experimental.animals treated with Ginkgo biloba extracts Correlation with pharmacological activity, Journal of Pharmaceutical and Biomedical nalysis, 2006, (40):763～768

[21]WANG Jian-Rong, ZHANG Jian, YIN, Zhi-Qi.et al.Chemical Constituents from the Seeds of Ziziphus jujuba var.spinosa[J].Chinese Journal of Natural Medicines, 2008, (4):268～270

[22]李善祥.腐植酸产品分析及标准[M].北京：化学工业出版社，2007：78，82，95～97