生化黄腐酸抑菌效果的研究

生化黄腐酸抑菌效果的研究_2015年论文集

生化黄腐酸抑菌效果的研究

高金岗　何　滨　安飞飞

(海南师范大学生命科学学院热带动植物生态学省部共建重点实验室　海口　571158)

摘　要：为了研究生化黄腐酸(BFA)对放线菌、酵母菌和桔青霉菌抑菌效果的最适条件，采用了4因素4水平的正交试验方案。4因素分别为BFA的浓度、培养基的pH值、培养温度和菌种的生长时期。以抑菌圈的直径为指标，显示BFA对3种菌的抑菌作用。结果表明： BFA对3种菌均有抑菌作用，且对放线菌的抑菌效果要好于对酵母菌和桔青霉菌。

关键词：生化黄腐酸　抑菌圈　抑菌作用　正交试验

The Study of BFA on Antimicrobial Effects

Gao Jingang,He Bin,An Feifei

(Co-constructing Key Labs by Hainan Province and Ministry of Education for Tropical Animal and Plant Ecology,

School of Life Sciences,Hainan Normal University,Haikou,571158)

Abstract: In order to study the optimal antibacterial conditions of biochemical fulvic acid (BFA)on Actinomycetes,Saccharomyces cerevisiae and Penicillium citrinum,4 factors and 4-level orthogonal test was adopted,in which 4 factors were the concentration of BFA,pH values of medium,incubation temperature and growth period of strains.The diameter of antibacterial zone was selected as an indicator of antibacterial effects and the antibacterial effect of BFA on three bacteria showed that: BFA had　antimicrobial effects on the three bacteria,but the antibacterial effects of BFA on Actinomycetes were　better than that on Saccharomyces cerevisiae and Penicillium citrinum.

Key words: BFA;antibacterial zone;antibacterial effect;orthogonal test

生化黄腐酸(biochemical fulvic acid，简称BFA)，是以特定的多种微生物菌株接种到植物培养基中，生成的高纯度的腐植酸制剂[1]。经过实验证明，BFA具有消炎、止痛、调整肠胃功能，提高机体免疫力等效果[2，3]。但目前对于它的抑菌效果、抑菌机理、抗菌谱及其作用环境的研究，国内外报导尚少。为了探索BFA对放线菌、酵母菌和桔青霉菌抑菌效果的最适条件，本研究中采用了4因素4水平的正交试验方案。以抑菌圈的直径为指标，显示BFA对上述3种菌的抑菌作用，并找出在现有条件下最优的试验条件组合，为今后有关BFA在抑菌作用方面的试验研究提供一定的参考和借鉴。

[收稿日期]2015-09-28

[作者简介]高金岗，男，1957年生，副教授，医学硕士，主要从事细胞生物学和酶组织化学方面的研究，E-mail：gf6363@ sina.com。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　药品

生化黄腐酸购自上海通微生物技术有限公司，棕褐色粉末，BFA≥95%。

1.1.2　供试菌种

菌种为放线菌(Actinomycetes)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)，桔青霉菌(Penicillium citrinum)，均由海南师范大学生命科学学院微生物学实验室提供。

1.1.3　培养基

培养基选用牛肉膏蛋白胨液体培养基。将其pH值调为6.0、6.8、7.6和8.4四组，121℃灭菌20min，待用。

1.1.4　主要仪器

722型分光光度计、恒温摇床、电子分析天平、恒温培养箱等。

1.2　方法

1.2.1　正交试验方案的制定[4]

为了了解生化黄腐酸对所选3种菌种的抑菌作用，选用了生化黄腐酸的浓度、pH值、培养温度和生长时期4个因素和4个水平的正交试验。各因素及其水平见表1。不考虑因子间的交互作用，4因素4水平试验最少需做的试验次数=(4-1)×4+1=13，从4n因素正交表中选用试验次数稍多于13的正交表安排试验。因此，选用L16(45)正交表比较合适。含有16个试验组合的正交试验方案见表2。

表1　BFA对3种菌抑菌作用正交试验的因素与水平表
Tab.1 Orthogonal test factor and level table for antibacterial effect of BFA on three common bacteria

表2　BFA抑菌作用的正交试验方案
Tab.2 Orthogonal test program for antibacterial effect of BFA

1.2.2　菌种生长时期的确定

首先绘制菌种的生长曲线，然后根据生长曲线来确定菌种生长时期[5]。方法：分别挑取放线菌、酵母菌和桔青霉菌接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，放入恒温摇床中，37℃振荡培养(振荡频率为250 r/min)；分别在培养2、3、4、6、　8、10、12、14、16、18 h和22 h时取出，放入分光光度计中，在600nm下测定其光密度(OD)。以OD值为纵轴，以时间为横轴，绘制菌种的生长曲线。

(1)放线菌生长时期的确定。

根据不同培养时间绘制的放线菌的生长曲线见图1。可以看出，在0～4 h时，放线菌的生长处于延滞期，4～8 h处于对数期，8～14 h处于稳定期，14 h后进入衰亡期。

图1　放线菌的生长曲线
Fig.1 The growth curves of actinomycetes

(2)酵母菌生长时期的确定。

根据不同培养时间绘制的酵母菌的生长曲线见图2。可以看出，在0～4 h时，酵母菌的生长处于延滞期，4～11h处于对数期，11～18 h处于稳定期，18 h后进入衰亡期。

图2　酵母菌的生长曲线
Fig.2 The growth curve of saccharomyces cerevisiae

(3)桔青霉菌生长时期的确定。

根据不同培养时间绘制的桔青霉菌的生长曲线见图3。可以看出，在0～4 h时，桔青霉菌的生长处于延滞期，4～10 h处于对数期，10～18 h处于稳定期，18 h后进入衰亡期。

图3　桔青霉菌的生长曲线
Fig.3 The growth curve of penicillium citrinum

由于微生物的生长曲线会受到很多条件的影响，如：菌种的接种量、接种龄、培养基的成分、温度等环境因素，因而为了避免试验的误差，当用分光光度计测得菌种吸光值出现以上4个生长时期的阶段特征时，随即取出，按已设计的正交表将该阶段的菌液涂布在特定pH值的培养基上。

1.2.3抑菌试验

(1)药敏纸片的制备[6]。

用口径为6mm的打孔器将滤纸打成直径为6mm的小圆纸片，经121℃高压灭菌20min，烘干，随后分别放入已制备好的各种浓度的BFA中浸泡20min，待用。

(2)采用滤纸片扩散法[7]测定抑菌强度。

在超净工作台上将灭菌后的培养基倒入灭菌后的培养皿中，每皿15～20mL，待冷却凝固后，用无菌的移液管吸取菌液滴入平板中，用涂布棒将菌液涂布均匀，然后将浸透过BFA的药敏纸片，贴在已涂菌液的平板上，每皿贴3片，将培养皿置于特定温度的恒温箱培养24 h，用卡尺测量各药敏纸片的抑菌圈直径(D)，依据抑菌圈直径(D)的大小判定BFA的抑菌效果。判定标准：抑菌圈直径(D)小于6mm为无抑菌作用，抑菌圈直径(D)等于或大于6mm为有抑菌作用，且抑菌圈的直径越大，抑菌作用则越强[8]。

2　结果与分析

2.1　BFA对菌种的抑菌作用

2.1.1　BFA对放线菌的抑菌作用

BFA对放线菌的抑菌作用的正交试验结果显示(表3)：16个组合抑菌圈的平均直径均大于6mm，表明BFA对所有组合均有抑菌作用，且当BFA的浓度取1水平(75mg/mL)、pH值取4水平(9.2)、温度取4水平(37℃)、生长时期取4水平(衰亡期)组合时，抑菌圈的平均直径最大(D=30mm)，抑菌效果最好。根据各因素各水平平均数的最大极差可以看出温度的极差最大，为15.64；pH值稍次，为14.48；生长时期的极差为11.74；浓度的极差最小，为9.14，表明温度和pH值是影响抑菌圈直径的关键因子。

表3　放线菌的正交试验结果及分析
Tab.3 Orthogonal experiment results and analysis of actinomycetes

注：T1、T2、T3、T4分别为各影响因素不同水平的总和；X1、X2、X3、X4分别为各因素各水平的平均数；Rmax为各因素各水平的最大极差值。下同。

2.1.2　BFA对酵母菌的抑菌作用

BFA对酵母菌抑菌作用的正交试验结果显示(表4)：16个组合抑菌圈的平均直径均大于6mm，表明BFA对所有组合均有抑菌作用，且当BFA的浓度取2水平(80mg/mL)、pH值取2水平(5.2)、温度取4水平(37℃)、生长时期取3水平(稳定期)组合时，抑菌圈的平均直径最大(D=9.8mm)，抑菌效果最好。根据各因素各水平平均数的最大极差可以看出：温度的极差最大，为7.30；pH值稍次，为7.26；浓度的极差为6.95；生长时期的极差为6.63，表明温度和pH值是影响抑菌圈直径的关键因子。

表4　酵母菌的正交试验结果及分析
Tab.4 Orthogonal experiment results and analysis of saccharomyces cerevisiae

2.1.3　BFA对桔青霉菌的抑菌作用

BFA对桔青霉菌抑菌作用的正交试验结果显示(表5)：16个组合抑菌圈的平均直径均大于6mm，表明BFA对所有组合均有抑菌作用，且当BFA的浓度取1水平(75mg/mL)、pH值取3水平(6.0)、温度取3水平(30℃)、生长时期取3水平(稳定期)组合时，抑菌圈的平均直径最大(D=9.8mm)，抑菌效果最好。根据各因素各水平平均数的最大极差可以看出温度的极差最大，为7.50；生长时期次之，为7.15；pH值的极差为7.03；浓度的极差值最小，仅为6.53，说明温度是影响抑菌圈直径的关键因子。

表5　桔青霉菌的正交试验结果及分析
Tab.5 Orthogonal experiment results and analysis of penicillium citrinum

3　结论与讨论

放线菌是一类主要呈菌丝状生长和以孢子繁殖的陆生性较强大的原核生物，革兰氏染色多呈阳性，由于与细菌十分接近，被认为是一类革兰氏阳性细菌；酵母菌和桔青霉菌均属于真菌，是一类真核微生物。

试验结果显示，BFA对试验中所选的3种菌(放线菌、酵母菌和桔青霉菌)均有抑制作用。BFA对放线菌的抑菌效果最为明显(D=30mm)，明显大于对酵母菌和桔青霉菌的抑菌效果(D均为9.8mm)。这可能是因为放线菌和真菌的细胞壁的化学成分有明显的不同所致。放线菌是一类革兰氏阳性细菌，其细胞壁的主要成分是肽聚糖和磷璧酸，酵母菌细胞壁的主要成分为“酵母纤维素”，桔青霉菌细胞壁的主要成分为几丁质[9]。试验结果表明，BFA可能对放线菌细胞壁的化学成分肽聚糖或者是磷璧酸更加敏感。至于BFA是如何作用于细胞壁上的肽聚糖或磷璧酸而产生抑菌效果的，还有待进一步研究。

放线菌有极强的分解纤维素、石蜡、角蛋白、琼脂和橡胶等的能力，因此，在环境保护，提高土壤肥力等方面起着重要作用。近年在农业上，BFA作为添加剂不仅广泛应用于化学肥料的改良，也开始应用于有机肥的改良，这极大地增强有机肥的肥效[10]。本试验中，BFA对放线菌有明显的抑制作用(D=30mm),因此，BFA作为有机肥增效剂使用时，还应考虑其对放线菌的影响，合理使用，以有益于土壤的改良。

细菌和真菌均易受外界环境因素的影响，各环境因子的改变都会在一定程度上影响到它们的生长或代谢，这便给研究BFA抑菌作用的环境问题带来了困难。本试验选用的正交试验法则为解决此问题提供了一种有效方法。应用正交试验方法可以找到最优试验条件组合以及影响BFA抑菌效果的关键因子。如本试验找到放线菌最优实验条件组合：既当BFA的浓度取1水平(75mg/mL)、pH值取4水平(9.2)、温度取4水平(37℃)、生长时期取4水平(衰亡期)组合时，抑菌圈的平均直径最大(D=30mm)，抑菌效果最佳。数据经极差分析后结果还显示：温度的极差最大，为15.64；pH值稍次，为14.48；生长时期为11.74；浓度最小，为9.14。表明本实验中，温度和pH值是影响BFA抑菌效果的关键因子。

有关BFA的抑菌机理、抗菌谱以及最佳的作用环境等方面，还有待深入研究。

参考文献

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[10]李瑞波.生物腐植酸与生态农业[M].北京：化学工业出版社，2008：76～82